[發明專利]級聯侵入信號放大反應結合納米金-寡核苷酸探針可視化核酸檢測方法

有效

• 申請號: 201110161736.3
• 申請日: 2011-06-16
• 公開（公告）號: CN102827922A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 周國華;馬寅姣;鄒秉杰
• 申請（專利權）人: 華東醫學生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 夏平;李曉峰

1.級聯侵入信號放大反應結合納米金-寡核苷酸探針可視化核酸檢測方法，其特征在于依次包括以下步驟：

(1)級聯侵入信號放大反應的第一步核酸侵入信號擴增階段：設計針對靶核酸特異性的一對探針，要求與靶核酸雜交后，上游探針3’端必須侵入下游探針1個堿基，下游探針有一段翹起片段，稱為5’flap，并且其中下游探針與靶核酸互補區域的解鏈溫度在核酸5’外切酶或5’flap內切酶的酶切反應溫度±1℃范圍內，而上游探針與靶核酸互補區域的解鏈溫度要高于核酸5’外切酶或5’flap內切酶的酶切反應溫度5～10℃；所述的靶核酸與所述的上、下游探針在核酸侵入反應體系中雜交形成探針-靶核酸特異性結構，其中下游探針濃度大于上游探針濃度；向反應體系中加入核酸5’外切酶或5’flap內切酶，核酸5’外切酶或5’flap內切酶識別所述的探針-靶核酸特異性結構，并將下游探針的5’flap連同與模板配對的第一個堿基切下，因為所述的酶切反應溫度接近下游探針與模板配對部分的熔解溫度，下游探針被切割后會很快與靶核酸分離，沒有被切割的完整的下游探針會再次與靶核酸雜交，而上游探針熔解溫度高于反應溫度，可以牢固地結合在靶核酸上，與新雜交的完整的下游探針再次形成所述的探針-靶核酸特異性結構，進而繼續被核酸5’外切酶或5’flap內切酶切割，形成flap片段的積累；

(2)級聯侵入信號放大反應的flap片段循環信號擴增階段：反應體系中的發卡探針可捕獲步驟(1)積累的flap片段，并雜交形成一個flap片段-發夾探針特異性結構，該結構也可被反應體系中的核酸5’外切酶或5’flap內切酶識別，并將發夾探針的5’flap連同與模板配對的第一個堿基切下，被切割的發夾探針與步驟(1)產生的flap片段分離，沒有被切割的完整的發夾探針會再次與步驟(1)產生的flap片段雜交，再次形成所述的flap片段-發夾探針特異性結構，進而繼續被核酸5’外切酶或5’flap內切酶切割，從而大量的發夾探針被切割；

(3)級聯侵入信號放大反應結果納米金-寡核苷酸探針可視化檢測階段：由于發卡探針5’端和3’端可分別與兩種納米金-寡核苷酸探針互補雜交，可使得納米金-寡核苷酸探針形成伸展的納米金顆粒-多核苷酸的多聚網狀結構，從而引發納米金的特征等離子吸收發生變化，并由此引發粒子光學性質的改變，產生發卡探針的檢測信號，即反應體系從紅色變為紫色；當反應體系中有靶核酸存在時，可觸發級聯信號放大反應，在酶的作用下，大量發卡探針被切割；待級聯信號放大反應結束后，向反應體系中加入兩種納米金-寡核苷酸探針；這時，由于發卡探針被切割，不能將兩種納米金-寡核苷酸探針連接，則不能引發納米金的特征等離子吸收發生變化，反應體系顏色不發生變化，仍然為紅色；相反，當反應體系中不存在靶核酸或靶核酸濃度過低時，則無級聯信號放大反應發生或級聯信號放大反應作用不明顯，體系中存在的發卡探針可使得納米金-寡核苷酸探針形成伸展的納米金顆粒-多核苷酸的多聚網狀結構，反應體系顏色由紅色變為紫色，從而顯示該體系中無靶核酸存在或靶核酸濃度過低。

2.根據權利要求1所述的可視化核酸檢測方法，其特征在于該方法能夠檢測到濃度為10fmol/L的靶核酸序列。

3.根據權利要求1所述的可視化核酸檢測方法，其特征在于所述的靶核酸為DNA或RNA。

4.根據權利要求1所述的可視化核酸檢測方法，其特征在于所述的核酸侵入反應體系包含MOPS、Tween-20、Nonidet?P40、上游探針、下游探針、發夾探針、MgCl₂以及靶核酸。

5.根據權利要求4所述的可視化核酸檢測方法，其特征在于所述的核酸侵入反應體系包括10mmol/LMOPS，pH?7.5，0.05％Tween-20，0.05％Nonidet?P40，0.1μmol/L上游探針，0.2μmol/L下游探針，0.2μmol/L發夾探針，7.5mM?MgCl₂和靶核酸。

6.根據權利要求1所述的可視化核酸檢測方法，其特征在于所述的核酸5’外切酶或5’flap內切酶選自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN或MthFEN。

7.根據權利要求6所述的可視化核酸檢測方法，其特征在于所述的5’flap內切酶為AfuFEN。

8.根據權利要求1所述的可視化核酸檢測方法，其特征在于步驟(1)或(2)所述的反應溫度可以通過恒溫水浴儀實現；步驟(3)所述的納米金-寡核苷酸探針檢測結果可通過人眼直接觀察，或拍照保存結果。