[發明專利]一種檢測調節性T細胞免疫抑制功能的方法

無效

• 申請號: 201110161298.0
• 申請日: 2011-06-15
• 公開（公告）號: CN102288587A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 顧鵬
• 申請（專利權）人: 顧鵬
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12Q1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

[技術領域]

本發明涉及一種細胞檢測方法技術領域，具體地說是一種檢測調節性T細胞免疫抑制功能的方法。

[背景技術]

調節T細胞，可以從自然調節性T細胞分化而來，也可以來自其他初始T細胞，表達CD25分子和Foxp3，其分化和發揮功能必需有特定細胞因子的參與。在維持外周免疫耐受，阻止自身免疫病的發生以及限制慢性炎癥性疾病等方面起到重要的作用。如今測定調節性T細胞的免疫抑制功能常采用3H-TdR摻入法，原理為T淋巴細胞受ConA或PHA激活后，進入細胞周期有絲分裂。當進入細胞周期S期時，細胞合成DNA量明顯增加，在培養基中加入氚(3H)標記的DNA前身物質胸腺嘧啶核苷(TdR)，則3H-TdR被作為合成DNA的原料被攝入細胞，摻入到新合成的DNA中。根據同位素摻入細胞的量可推測淋巴細胞對刺激物的應答水平。摻入的同位素3H經液體閃爍測量法測出，將3H每分脈沖數(cpm)加以計算，用不同公式表示結果。

該方法不但需要專門的昂貴設備如液體閃爍儀、細胞收集儀和專門的試劑如β液體閃爍液等，更重要的是同位素3H可以造成對周圍環境的放射性污染。

[發明內容]

本發明的目的就是要解決上述的不足，而提供一種檢測調節性T細胞免疫抑制功能的方法。

為實現上述目的設計了一種檢測調節性T細胞免疫抑制功能的方法，其中該方法步驟包括：

1)純化CD4⁺T細胞并用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌；

2)10⁷CD4⁺T細胞重懸于500μl預熱的PBS磷酸鹽緩沖液中；

3)加入等體積CFSE羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂，預熱PBS磷酸鹽緩沖液5μM，CFSE羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂終濃度為2.5μM；

4)室溫孵育2分鐘；

5)加入等體積的胎牛血清，室溫孵育1分鐘；

6)完全培養基洗滌3次，重新計數，加入96孔板培養5天；

7)加入調節性T細胞，第5天時根據CFSE羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂的強弱檢測其對反應細胞的抑制能力。

所述室溫孵育為避光條件。

本發明的有益效果：

1.安全：不需使用放射性同位素，不存在安全隱患；

2.時間長：標記的熒光可以維持長達數周之久；

3.活體標記：可以追蹤細胞在體內的分裂增殖過程；

4.相關性高：與H3摻入法結果一致，可代替后者；

5.特定跟蹤：可以與細胞亞群特定抗體結合使用；

6.簡單：操作簡單，可靠；

7.穩定：進入細胞后熒光不受內環境影響；

8.結果客觀：對細胞生理活動沒有任何影響；

9.經濟實惠：費用經濟，效率高。

[附圖說明]

圖1是本發明的方法步驟圖；

圖2是本發明的細胞分裂增殖圖；

圖3是本發明CFSE強度檢測示意圖；

[具體實施方式]

下面結合附圖對本發明作以下進一步說明：

本發明的方法步驟包括：

8)純化CD4⁺T細胞并用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌；

9)10⁷CD4⁺T細胞重懸于500μl預熱的PBS磷酸鹽緩沖液中；

10)加入等體積CFSE羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂，預熱PBS磷酸鹽緩沖液5μM，CFSE羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂終濃度為2.5μM；

11)室溫孵育2分鐘，避光條件；

12)加入等體積的胎牛血清，室溫孵育1分鐘，避光條件；

13)完全培養基洗滌3次，重新計數，加入96孔板培養5天；

14)加入調節性T細胞，第5天時根據CFSE羥基熒光素二醋酸鹽琥珀

酰亞胺脂的強弱檢測其對反應細胞的抑制能力。