[發(fā)明專利]山羊毛囊外根鞘細(xì)胞系的構(gòu)建方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110158575.2
• 申請(qǐng)日: 2011-06-14
• 公開（公告）號(hào): CN102226169A
• 公開（公告）日: 2011-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王慧;崔志峰;胡艷霞;曾勇慶;陳維云;周芬娜;董忠典;張嬌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
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一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及山羊毛囊外根鞘細(xì)胞系的構(gòu)建方法，屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。

二、技術(shù)背景

毛囊（Hair?follicle）是表皮向真皮凹陷后形成的能控制毛發(fā)生長(zhǎng)的皮膚附屬器官，是由胚胎期神經(jīng)外胚層與間充質(zhì)相互作用，最終發(fā)育形成的由多層細(xì)胞組成的、具有合成多種特異角質(zhì)蛋白功能的復(fù)雜的動(dòng)態(tài)器官，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和周期性再生的能力。毛囊在形成與分化過程中至少涉及到20余種不同的細(xì)胞群，主要由毛乳頭、毛母質(zhì)、內(nèi)根鞘和外根鞘等細(xì)胞組成。其中，外根鞘細(xì)胞（Outer?root?sheath?cell,?ORSC）作為一種重要的毛囊上皮細(xì)胞，因具有高度增生的潛能，在毛發(fā)再生、傷口愈合、初級(jí)毛囊和次級(jí)毛囊分化等生理過程中均起著重要作用，因而越來越受到高度關(guān)注。

自Wetering?等（1981）利用經(jīng)鈷源照射后的牛晶狀體包膜囊作為支持物，成功誘導(dǎo)人毛囊外根鞘細(xì)胞遷移出游離毛囊以來，已有不少學(xué)者針對(duì)ORSC體外培養(yǎng)體系與技術(shù)進(jìn)行過改進(jìn)。其中，Well等（1982）將分離的毛囊直接接種到塑料培養(yǎng)皿中，在控制培養(yǎng)液pH不高于7.2的條件下，貼壁毛囊周圍便可游離出外根鞘細(xì)胞，但該方法獲得的外根鞘細(xì)胞產(chǎn)量低且再生能力差，不便于進(jìn)行進(jìn)一步的研究與大量的應(yīng)用。迄今，已有多種細(xì)胞分離技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)方法運(yùn)用于ORSC的體外培養(yǎng)，其中，較為常用的培養(yǎng)方法有兩種：一種是將分離的毛囊經(jīng)胰蛋白酶消化處理后，用含10%胎牛血清（Fetal?bovine?serum，F(xiàn)BS）的DMEM/F12培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，然后接種于經(jīng)絲裂霉素處理的3T3細(xì)胞滋養(yǎng)層上，37℃、5%CO₂條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)（Rheinwald?K.?et?al.,?1985;?Limat?A.?et?al.,?1986;?Sabolinski?M.?L.?ea?al.,?1996;?Naughton?G.?et?al.,?1997;?McElwee?K.?J.?et?al.,?2003;?唐建兵等，2005）；另一種則是利用膠原包埋法進(jìn)行外根鞘細(xì)胞的培養(yǎng)：分離帶有外根鞘部位的毛囊，37℃下進(jìn)行胰酶消化處理，隨后將毛囊轉(zhuǎn)移至Ⅰ型和Ⅳ型膠原包被的塑料培養(yǎng)皿中，加入含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待毛囊牢固貼附于培養(yǎng)皿底壁后，換用無血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)（Detmar?M.?et?al.,?1993;?Sotaro?K.?et?al.,?1994;?Limat?A.?et?al.,?1996;?Schirren?C.G.?et?al.,?1997;?Oshima?H.?et?al.,?2001;?Juergen?S.?et?al.,?2008;?伍津津等，2008）。以上兩種方法雖均能獲得毛囊外根鞘細(xì)胞，但仍存在少量非外根鞘細(xì)胞，且細(xì)胞傳至8~10代后出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，以致無法繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

上述外根鞘細(xì)胞的培養(yǎng)多以人的毛囊為細(xì)胞的組織來源。對(duì)于其它哺乳動(dòng)物ORSC的培養(yǎng)，主要借鑒人毛發(fā)外根鞘細(xì)胞培養(yǎng)方法。研究表明，將分離得到的小鼠觸須毛囊接種于含有表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal?growth?factor，EGF）及10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，且細(xì)胞培養(yǎng)板預(yù)先用經(jīng)絲裂霉素C處理的表皮細(xì)胞滋養(yǎng)層覆蓋，可成功分離得到純一的ORSC并穩(wěn)定生長(zhǎng)至8~10代（Jahoda?CA.?et?al.,?2001;?鐘白玉等，1999；高強(qiáng)國(guó)等，2004）。亦有學(xué)者在上述分離培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，成功分離培養(yǎng)了大鼠、牛、羊駝、豬、兔等動(dòng)物的毛外根鞘細(xì)胞及其它毛囊細(xì)胞（Tsuyoshi?H.?et?al.,?2001;?Miyashita?H.?et?al.,?2004;?Christiano?AM.?et?al.,?2004;?陳大元等，1999；魏泓等，2004；李鍵等，2007）。盡管許多學(xué)者在動(dòng)物毛囊細(xì)胞培養(yǎng)方面進(jìn)行了大量的研究，但有關(guān)山羊毛囊細(xì)胞體外培養(yǎng)研究，尤其是外根鞘細(xì)胞系建立等方面的報(bào)道相對(duì)較少，可應(yīng)用于動(dòng)物毛囊研究方面的細(xì)胞株與細(xì)胞系亦不多。因此，有必要建立體外培養(yǎng)毛囊外根鞘細(xì)胞系和完善培養(yǎng)方法，為進(jìn)一步開展毛囊細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化等研究建立離體細(xì)胞模型。

三、發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題