[發明專利]山羊毛囊外根鞘細胞系的構建方法

無效

• 申請號: 201110158575.2
• 申請日: 2011-06-14
• 公開（公告）號: CN102226169A
• 公開（公告）日: 2011-10-26
• 發明（設計）人: 王慧;崔志峰;胡艷霞;曾勇慶;陳維云;周芬娜;董忠典;張嬌
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種山羊毛囊外根鞘細胞系的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

a、活體采集1~3日齡濟寧青山羊體側偏背部皮膚0.5cm×0.5cm大小的含完整毛囊的皮膚組織樣，將皮膚組織樣用碘酒和酒精消毒，再用生理鹽水洗凈酒精后迅速放入無血清DMEM/F12培養液，于冰盒中帶回實驗室，在12h內進行分離培養；

b、預先采用組織塊貼壁方法，分離并培養山羊皮膚成纖維細胞于6孔細胞培養板中，待細胞生長至會合時，除去所述無血清培養液，按每孔3mL量加入含1%?Triton?X-100溶液，37℃孵育30min后，去除Triton?X-100溶液，用無菌超純水沖洗干凈，置于4℃下備用；

c、將皮膚組織樣經無菌化處理剪成組織懸液，利用Dispase酶分離皮膚表、真皮層后拔出毛囊，采用組織培養與消化培養相結合的方法，將游離毛囊進行胰蛋白酶消化處理后接種于上述6孔細胞培養板中，每孔加入3mL量含10ng/mL?EGF、10ng/mL?IGF-I、0.4μg/mL氫化可的松和10%FBS的DMEM/F12完全培養液，在37℃，5%CO₂濃度飽和濕度條件下進行培養；約4—5天待毛囊周圍遷移出大量細胞后，更換為等量含10ng/mL?IGF-I、10ng/mL?EGF、0.4μg/mL?氫化可的松的無血清角質細胞培養液，在37℃，5%CO₂濃度飽和濕度培養箱中啟動原代培養；待游離出的毛囊外根鞘細胞生長成單層后，消化移入培養瓶中，按照每瓶10mL量加入含10ng/mL?IGF-I、10ng/mL?EGF、0.4μg/mL?氫化可的松的無血清角質細胞培養液進行培養，每2~3天更換一次工作培養液；

d、當毛囊外根鞘細胞生長至會合狀態后，進行傳代；待ORSC穩定生長至8~10代時，更換成10mL含10ng/mL?IGF-I、10ng/mL?EGF、0.4μg/mL?氫化可的松和2%FBS的DMEM/F12維持培養液進行培養，以利于外根鞘細胞在體外長期傳代；

e、選擇對數生長期細胞，利用傳代培養的方法制成細胞懸液，然后加入含10%?DMSO和30%?FBS的DMEM/F12凍存培養液并分裝入無菌凍存管中，封口，標記；將凍存管依次置于4℃1h、-20℃1h、-70℃12h，最后移入液氮中長期保存細胞；復蘇細胞時，用40℃溫水快速解凍細胞，按5×10⁵個/mL的細胞密度接種于培養瓶。