[發明專利]一種采用基因工程菌發酵產酶制備利巴韋林的方法

無效

• 申請號: 201110158250.4
• 申請日: 2011-06-14
• 公開（公告）號: CN102286574A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 陳寧;謝希賢;夏俊剛;徐慶陽;劉淑云
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12P19/28
• 分類號: C12P19/28;C12N15/55;C12N15/63;C12N1/21;C12N9/16;C12R1/19
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術領域

本發明涉及生化工程領域，特別是一種采用基因工程菌發酵產酶制備利巴韋林的方法。

背景技術

利巴韋林(ribavirin)，化學名為1-β-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酰胺，別名病毒唑，是一種廣譜抗病毒藥物，對多種DNA和RNA病毒均有顯著抑制作用，在抗病毒臨床實踐中得到廣泛應用。

利巴韋林生產方法有化學合成法、發酵法和酶法。目前，國內在工業生產上實施的化學合成法占絕大多數，該方法存在副產物多、產率低、操作步驟復雜、污染嚴重、成本高等不足。

添加前體物發酵法(日本公開專利17830/1979)雖具有原料成本低、來源廣泛、能耗低等優點，但是不足之處在于生產效率低、副產物多、利巴韋林分離純化成本高，另外必須每次培養菌體且發酵時間長、生產成本高，目前仍處于實驗室研究階段。

酶法由Witkowski等首創，在上個世紀80、90年代發展起來，先后經歷了三個主要階段：一是以純酶催化核糖-1-磷酸和TCA(1，2，4-三氮唑-3-羧甲酰胺)一步式生產利巴韋林(US?Patent?3,976,545/1976)；二是以自然界篩選的或人工誘變育種獲得的微生物菌體為酶源，以肌苷、胞苷、鳥苷和腺苷等作為核糖供體酶促合成利巴韋林(Fujishima，1986；US?Patent?4614719；US?Patent?5384251；Shirae，1988；Pochodylo，1989；邱蔚然，1997；陳薇梅，02115486.4/2002)；三是以基因工程菌菌體為酶源，以鳥苷和TCA為底物合成利巴韋林。改進后的酶法具有以下優點：1)反應效率高、收率高；2)反應時間短、副產物少、分離精制容易；3)三廢較易處理，對環境污染較小；4)酶源可以反復連續使用；5)在微生物不增殖條件下，以較高的溫度(40～60℃)反應，幾乎沒有雜菌污染；6)核糖供體可以從多種核苷、核苷酸中選擇，底物來源廣泛。但是，現有技術普遍存在的問題主要有：1)利巴韋林的產率受核苷磷酸化酶活性的限制，天然的或傳統誘變獲得的微生物中，核苷磷酸化酶表達量仍舊很低；2)現有構建的基因工程菌需要昂貴的化學誘導劑異丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷(IPTG)的誘導才能高效表達目的蛋白，增加了生產成本，不適合工業化生產；3)在嘌呤核苷或類似物的酶法合成中，人們把注意力集中在篩選具有廣泛底物特異性的高分子量六聚體嘌呤核苷磷酸化酶，盡管報道的底物轉化率最高可達98％，但是所用底物濃度為20mmol/L，無法滿足工業化需要。

而將低分子量嘌呤核苷磷酸化酶用于酶法合成利巴韋林的應用在國內外尚未見報道。針對以上情況，構建具有高效率表達、高催化活性的非化學試劑誘導型的利巴韋林工程菌，可進一步實現并提高酶法合成利巴韋林的效率和降低生產成本。

發明內容

本發明的目的是針對上述存在問題，提供一種采用基因工程菌產酶發酵酶法制備利巴韋林的方法，所述基因工程菌為高效表達具有高酶活力的低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶，該制備方法提高了酶活和酶量、縮短了生產周期、提高了生產效率、降低了生產成本。

本發明的技術方案：

本發明所涉及的高效表達具有高酶活力的低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶基因工程菌已經公開，編碼高酶活力的低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆表達、重組蛋白純化及酶學性質研究已于2010年12月在《中國生物工程雜志》第30卷第12期發表，獲得的高效表達高酶活力的低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶的工程菌E.coli?XL-Blue(pPNP₈₁₆)現保藏于天津科技大學代謝工程研究室。

一種采用基因工程菌發酵產酶制備利巴韋林的方法，步驟如下：

1)利用分子生物學技術構建高效表達具有高酶活力的低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌E.coli?XL-Blue(pPNP₈₁₆)，具體方法是：利用PCR技術從枯草芽孢桿菌W168中擴增低分子量嘌呤核苷磷酸化酶編碼基因punA，與啟動子部分經改造的表達載體pQE-30連接，構建具有高效表達和高質粒穩定性的組成型表達載體pQF-PNP₈₁₆和基因工程菌E.coli?XL-Blue(pPNP₈₁₆)；

2)基因工程菌高密度產酶發酵：