[發(fā)明專利]一種采用基因工程菌發(fā)酵產酶制備利巴韋林的方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201110158250.4 | 申請日： | 2011-06-14 |
| 公開（公告）號： | CN102286574A | 公開（公告）日： | 2011-12-21 |
| 發(fā)明（設計）人： | 陳寧;謝希賢;夏俊剛;徐慶陽;劉淑云 | 申請（專利權）人： | 天津科技大學 |
| 主分類號： | C12P19/28 | 分類號： | C12P19/28;C12N15/55;C12N15/63;C12N1/21;C12N9/16;C12R1/19 |
| 代理公司： | 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002 | 代理人： | 侯力 |
| 地址： | 300457 天津市塘沽區(qū)經濟*** | 國省代碼： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 采用 基因工程 發(fā)酵 制備 利巴韋林 方法 | ||
1.一種采用基因工程菌發(fā)酵產酶制備利巴韋林的方法，其特征為步驟如下：
1）利用分子生物學技術構建高效表達具有高酶活力的低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌E.?coli?XL-Blue（pPNP816），具體方法是：利用PCR技術從枯草芽孢桿菌W168中擴增低分子量嘌呤核苷磷酸化酶編碼基因punA，與啟動子部分經改造的表達載體pQE-30連接，構建具有高效表達和高質粒穩(wěn)定性的組成型表達載體pQF-PNP816和基因工程菌E.?coli?XL-Blue（pPNP816）；
2）基因工程菌高密度產酶發(fā)酵：
從新鮮活化斜面分別挑取一環(huán)工程菌E.?coli?XL-Blue（pPNP816）菌苔于種子培養(yǎng)基中，在轉數(shù)為200r/min、溫度為35℃條件下振蕩培養(yǎng)6h；然后將培養(yǎng)的種子接入產酶發(fā)酵培養(yǎng)基進行產酶發(fā)酵，接種量按體積百分比計為2%~10%，產酶發(fā)酵工藝為：發(fā)酵溫度33~35℃、罐壓0.01~0.2MPa、用質量百分比濃度為25%的氨水調節(jié)發(fā)酵液的pH值7.0~7.2、在空氣流量1~50L/min和攪拌速度200~800r/min條件下使溶氧維持在15~40%、流加質量百分比濃度為80%的葡萄糖維持殘?zhí)菫?.2%~1%、發(fā)酵時間16~20h；
3）酶源制備：將發(fā)酵完畢的發(fā)酵液離心后得到菌體細胞作為酶源，將菌體細胞用濃度為50mmol/L、pH為7.6的磷酸鈉緩沖液洗滌兩遍，然后將該酶源用上述磷酸鈉緩沖液重懸作為反應液備用；
4）酶促反應制備利巴韋林：以鳥苷和1，2，4-三氮唑-3-甲酰胺（TCA）為反應底物，鳥苷與TCA的摩爾比為1：1~1.3，底物在反應液中的濃度為50~300mmol/L，在反應底物中加入酶源并混合均勻，酶源在反應液中的用量按濕重計為30~120g/L，反應溫度為50~60℃，反應12~20h，反應完畢后經離心取得清液，即為產物利巴韋林。
2.根據(jù)權利要求1所述采用基因工程菌發(fā)酵產酶制備利巴韋林的方法，其特征在于：所述種子培養(yǎng)基中各組分的質量百分比為：葡萄糖2.5%~5%、牛肉膏?1%~3%、酵母粉?0.5%-2%、MgSO4·7H2O?0.1%~0.2%、KH2PO4?0.1%~0.2%、玉米漿?0.2%~1%、豆?jié)?0.2%~1%、余量為水。
3.根據(jù)權利要求1所述采用基因工程菌發(fā)酵產酶制備利巴韋林的方法，其特征在于：所述產酶發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的質量百分比為：葡萄糖?1%~4%、酵母膏?0.1%~0.3%、豆?jié)?1%~2%、玉米漿?1%~2%、MgSO4·7H2O?0.1%~0.2%、KH2PO4??0.2%~0.4%、FeSO4?0.0002%~0.0004%、MnSO4·H2O?0.001~0.004%、CoCl2·6H2O?0.0002%~0.0004%、ZnSO4·7H2O?0.0001%~0.0002%、余量為水。
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