[發(fā)明專利]一種可誘使顆粒化的多肽及其用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110154637.2
• 申請日: 2011-06-08
• 公開（公告）號: CN102816216A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李少偉;楊春燕;張曉;顧穎;袁權(quán);夏寧邵
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué);廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C07K14/08
• 分類號: C07K14/08;C07K19/00;C12N15/51;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;A61K39/00
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會專利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 羅菊華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種可使目標(biāo)蛋白發(fā)生聚集或顆粒化的多肽(Multimerization-Inducing?Peptide，MIP)，利用所述多肽形成的聚集體(aggregate)或顆粒可應(yīng)用于疫苗研制、診斷信號放大、納米顆粒制作等用途。具體而言，本發(fā)明提供了一種可使目標(biāo)蛋白發(fā)生聚集或顆粒化的多肽，其序列和相關(guān)編碼序列，其用于使目標(biāo)蛋白發(fā)生聚集或顆粒化的方法和用途，根據(jù)所述方法獲得的蛋白顆粒，以及這些顆粒用于疫苗、診斷或納米技術(shù)的用途。本發(fā)明還提供這類顆粒的體外組裝機(jī)制和方法，及其用于疫苗、顆粒抗原或納米顆粒的制備用途。

背景技術(shù)

在生物有機(jī)體的生命活動中，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用普遍存在，如病毒組裝過程中的單體-單體、子粒-子粒間、免疫系統(tǒng)中的抗原-抗體、生化反應(yīng)中的酶-底物、信號傳導(dǎo)中的效應(yīng)分子-受體、病毒感染中的病毒-細(xì)胞受體以及等等，均是通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用發(fā)揮其特有的生物學(xué)功能。生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)揭示，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可通過疏水相互作用、范德華力、靜電相互作用等形式進(jìn)行，一般具有很高的特異性，其還可能誘發(fā)變構(gòu)現(xiàn)象、級聯(lián)效應(yīng)。相互作用過程也是熱力學(xué)和動力學(xué)的過程，伴隨著熵、焓和自由能的變化。

在諸多的蛋白相互作用形式中，病毒衣殼獨(dú)特地以少數(shù)的衣殼蛋白或包膜蛋白進(jìn)行有序的排列聚集，可形成數(shù)十納米甚至數(shù)百納米的顆粒形式，其組裝過程受到了嚴(yán)格的調(diào)控，從而，行使包裹基因組DNA/RNA，識別宿主細(xì)胞上的病毒受體、發(fā)生構(gòu)象變化、脫衣殼等生物學(xué)功能。這些衣殼有不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)，如：球形、桿狀、彈狀、磚形、冠狀、杯狀、環(huán)狀、輪狀、腎形和嵌沙樣等。但基本形態(tài)的對稱型可分為4種，即螺旋對稱、立體對稱(主要為二十面體對稱)、復(fù)合對稱和復(fù)雜對稱。其中以等二十面體對稱最為普遍。

人們通過基因工程的手段利用各種表達(dá)系統(tǒng)，如大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、CHO細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等，外源表達(dá)病毒的全部或部分衣殼蛋白，可模擬病毒進(jìn)行衣殼的組裝，獲得類似于病毒形態(tài)和結(jié)構(gòu)的人工衣殼，亦稱病毒樣顆粒(Virus?Like?Particle，VLP)。VLP具有與其來源的病毒相類似的結(jié)構(gòu)特征和抗原性，且不含有病毒基因組核酸，具有良好的安全性，因此是一種理想的疫苗形式，如已經(jīng)取得成功的基因工程重組乙肝疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗等。VLP還被證明可以插入或融合異源的抗原序列，產(chǎn)生嵌合顆粒并將外源抗原暴露展示在顆粒的表面。VLP還可經(jīng)由化學(xué)偶聯(lián)方法連接外源抗原，包括蛋白組分和非蛋白組分(如糖基)，VLP這時也被稱為載體。比起一般的單體或寡聚抗原，顆粒化抗原更易被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識別而誘導(dǎo)相應(yīng)的體液或細(xì)胞免疫(Grgacic?EV，Ander?son?DA.Methods.2006.40：60-65)。VLP的大小屬于納米級別，已被證明可與金屬原子結(jié)合而制備成納米顆粒，可能具有與化學(xué)制備的納米顆粒相同的性質(zhì)，且具有病毒抗原的特性。

VLP是一種有序的聚集形式，因此，可能存在關(guān)鍵的核心聚集元件。本發(fā)明就是基于這樣的假設(shè)，而發(fā)明了通用的可誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白發(fā)生聚集和顆粒化的多肽。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)包括了多個行使不同功能的結(jié)構(gòu)域。例如，HEV的衣殼蛋白包括S殼結(jié)構(gòu)域、P1突出結(jié)構(gòu)域和P2外突出結(jié)構(gòu)域(Yamashita?T，et?al.PNAS.2009.106(31)：12986-12991.Guu?TS，et?al.PNAS.2009.106(31)：12992-12997)。一般認(rèn)為，S結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了衣殼的基層結(jié)構(gòu)，而P結(jié)構(gòu)域突出于顆粒表面，形成了抗原表位的結(jié)構(gòu)域。

蛋白質(zhì)在外源表達(dá)時，某些N端的氨基酸序列或者N端融合多肽的引入常常有利于增加蛋白質(zhì)的表達(dá)量以及改善蛋白質(zhì)的折疊性質(zhì)。某些多肽，如GST(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)、Trx(硫氧還蛋白)、MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)、His?Tag(串聯(lián)組氨酸標(biāo)簽)等，常被用作融合蛋白與目標(biāo)多肽進(jìn)行融合表達(dá)，所獲得的蛋白經(jīng)常具有較高的產(chǎn)量、得以較好的折疊，且有利于進(jìn)行親和層析。這些融合蛋白的對應(yīng)的商售pGEX、pTrxFUS、pMAL、pET質(zhì)粒載體就是利用融合蛋白進(jìn)行高效表達(dá)和純化。本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體中的MIP多肽能夠輔助蛋白高產(chǎn)量表達(dá)和正確折疊，且誘發(fā)形成的顆粒能夠從分子大小的性質(zhì)上與一般的蛋白相區(qū)分，易于通過基于分子大小進(jìn)行分離的純化方式達(dá)到純化的目的，如使用分子篩層析、非變性聚丙烯酰胺/瓊脂糖電泳、超速離心等方法進(jìn)行分離純化。

發(fā)明內(nèi)容