[發明專利]賴氨酸的流加發酵制備

有效

• 申請號: 201110151495.4
• 申請日: 2011-06-08
• 公開（公告）號: CN102234666A
• 公開（公告）日: 2011-11-09
• 發明（設計）人: 馬吉銀;陳崇安;孟剛;曹洪;程耀東;劉鑫
• 申請（專利權）人: 寧夏伊品生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12P13/08
• 分類號: C12P13/08;C12R1/15
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于氨基酸發酵領域，具體而言，本發明涉及流加發酵L-賴氨酸的方法，其包括將表達吡啶核苷酸轉氫酶變體的工程菌接入第一發酵罐于培養并將獲得的培養液接種于第二發酵罐培養，然后向第二發酵罐持續流加糖，之后再向第二發酵罐持續流加糖和氮源。另外，本發明還提供了所述方法生產的產品等。

背景技術

L-賴氨酸是重要的氨基酸原料，可以作為調味品、食品、飼料添加劑使用，也可以作為保健品、藥品中的有效或輔料成分，廣泛應用于食品業、飼料業、制藥業及其他化學工業中。當前，L-賴氨酸的生產主要是通過微生物的發酵生產的，如可以利用棒狀桿菌生產。

用于發酵生產的微生物可以是野生型微生物，但是更多的是通過誘變或基因工程獲得的產量更高的營養缺陷型、耐藥變異型和代謝變異型微生物。對于基因工程獲得的性狀改良的微生物來說，其中至關重要的就是性質優異的基因。

吡啶核苷酸轉氫酶是L-賴氨酸代謝途徑上重要的酶。盡管野生型吡啶核苷酸轉氫酶的亞基已經被公開(可參見NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)蛋白和基因登錄號NP416120.1和AAC74674.1；也可參見中國專利ZL94194707)，但是該酶變體的研究卻沒有報道。

本發明人經過長期艱苦研究，除了令人意外地發現了新的顯著提高酶活性的吡啶核苷酸轉氫酶之外，本發明人更詳細地研究了適合含有該酶的工程菌發酵的方法，在實際生產中增加了賴氨酸的產量。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于提供新的流加發酵L-賴氨酸的方法，其包括將包括將表達吡啶核苷酸轉氫酶變體的工程菌接入第一發酵罐于培養并將獲得的培養液接種于第二發酵罐培養，然后向第二發酵罐持續流加糖，之后再向第二發酵罐持續流加糖和氮源。另外，本發明還提供了所述方法生產的產品等。

具體而言，在第一方面，本發明提供了持續流加發酵L-賴氨酸的方法，其包括：

(1)將表達吡啶核苷酸轉氫酶變體的工程菌接入第一發酵罐于31-38℃培養10-20小時，其中所述吡啶核苷酸轉氫酶變體相對于野生型吡啶核苷酸轉氫酶的活性提高；

(2)將步驟(1)獲得的培養液以3-7％(體積)的接種量接種于第二發酵罐，于36-40℃培養3-8小時；

(3)向第二發酵罐持續流加糖，其中糖的每小時流加量為第二發酵罐內培養液量的0.2-0.35％(重量)，進行10-18小時；和

(4)向第二發酵罐持續流加糖和氮源，其中糖的每小時流加量為第二發酵罐內培養液量的0.3-0.5％(重量)，而且氮源的每小時流加量為第二發酵罐內培養液量的0.1-0.25％(重量)，進行30-65小時，優選50-55小時。

在本文中，“第一”和“第二”在修飾發酵罐的時候，是為了區分所修飾的發酵罐，即第一發酵罐和第二發酵罐是不同的。在本文中，接種量具有本領域技術人員所能常規理解的含義，具體在以體積百分比表示的時候，指的是菌體培養液(接入的菌液)體積相對于被接入的培養基體積的百分比量。

優選在本發明第一方面的方法中，第一發酵罐中的培養基配方為：每18立方米培養基中含，葡萄糖500-750公斤，甘蔗糖蜜50-300公斤，玉米漿400-600公斤，KH₂PO₄?30-80公斤，MgSO₄·7H₂O?3-15公斤，FeSO₄·7H₂O?0.1-1公斤，MnSO₄·7H₂O?0.1-1公斤，生物素5-30克，和葉酸3-10克。在本發明的具體實施方式中，第一發酵罐中的培養基配方為：每18立方米培養基中含，葡萄糖600公斤，甘蔗糖蜜200公斤，玉米漿520公斤，KH₂PO₄?45公斤，MgSO₄·7H₂O?7公斤，FeSO₄·7H₂O?0.5公斤，MnSO₄·7H₂O?0.5公斤，生物素12克，和葉酸5克。