[發明專利]雪卡毒素鈉離子熒光探針檢測法

有效

• 申請號: 201110149270.5
• 申請日: 2011-06-03
• 公開（公告）號: CN102253023A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 袁建輝;楊慧;劉建軍;徐新云;柯躍斌;程錦泉;莊志雄
• 申請（專利權）人: 深圳市疾病預防控制中心
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12Q1/02
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所 44248
• 代理人: 胡吉科;孫偉

技術領域

本發明屬于熒光檢測方法領域，尤其涉及雪卡毒素鈉離子熒光探針檢測法。?

背景技術

當前，世界各國都在積極地開展雪卡毒素的檢測和預防方面的研究。已有多種檢測分析方法的研究成果，雪卡毒素的檢測方法目前主要有：小鼠生物法，免疫學檢測法，高效液相色譜-質譜聯用法，以及傳統的細胞檢測法。?

20世紀90年代末國外研究者首次報道雪卡毒素能與鈉離子通道蛋白結合，使鈉離子通道開放，具有鈉離子通道激活劑的性質。傳統的細胞檢測法是利用雪卡毒素對細胞的毒性效應來檢測毒素的一種技術。其基本原理是利用雪卡毒素使鈉離子通道開放的性質，結合鈉鉀泵抑制劑，當雪卡毒素和鈉鉀泵抑制劑共同作用于細胞時，鈉離子過度內流，造成細胞腫脹，甚至死亡。當加入了拮抗劑毒素（如河豚毒素等）時，可使部分細胞“救活”，從細胞存活率或者死亡率可反映雪卡毒素的存在。?

傳統的細胞檢測法通過細胞的存活狀況來進行雪卡毒素含量的檢測，而雪卡毒素使鈉離子通道開放的性質不一定導致細胞死亡，細胞的死亡也不一定都是由Na^?+離子內流導致，因此傳統的細胞檢測法存在靈敏度較低，特異性不高，檢測結果容易受干擾的缺點。?

發明內容

為解決現有技術中存在的靈敏度較低，特異性不高，檢測結果容易受干擾的問題，本發明提供一種雪卡毒素鈉離子熒光探針檢測法，可通過直接檢測細胞鈉離子流的變化來檢測雪卡毒素。?

一種雪卡毒素鈉離子熒光探針檢測法，包括如下步驟：?

A）培養細胞，種96孔黑板，置于細胞培養箱中培養；

B）培養24?h后，棄去培養基，PBS洗滌2~3次，選用不同濃度的雪卡毒素染毒細胞；

C）染毒12~24?h后，棄去培養基，加入鈉離子熒光探針染色，置于細胞培養箱中避光孵育；

D）平衡鹽溶液洗滌2~3次后，多功能酶標儀檢測各孔的熒光強度；

E）建立鈉離子熒光探針檢測法的標準曲線。

作為本發明的進一步改進，所述步驟A）包括：培養小鼠腦神經瘤細胞（N-2a），待細胞長至80~90%匯合度，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收集細胞，離心后去上清液，加入RPMI-1640培養基重懸細胞使其密度為3×10⁵個/mL，接種100?μL細胞懸液于96孔黑板中，置于細胞培養箱中培養。小鼠腦神經瘤細胞購自中科院上海細胞庫，其鈉離子通道豐富，對雪卡毒素敏感，接種量適當，有利于提高雪卡毒素檢測的靈敏度。?

作為本發明的進一步改進，所述步驟B）包括：每孔加入90?μL0.25?mmol/L的烏苯苷溶液和10?μL?雪卡毒素標準品（P-CTX-1）或樣品溶液，雪卡毒素標準品的濃度梯度為1~10⁷?pg/L；設置空白對照組：每孔加入100?μL?RPMI-1640基礎培養基；設置溶劑對照組：每孔加入90?μL0.25?mmol/L的烏苯苷溶液和10?μL?10%甲醇。雪卡毒素能與鈉離子通道蛋白質結合，激活鈉離子通道，使鈉離子內流。在消耗ATP的情況下，細胞膜表面的鈉鉀泵能不斷地將鈉離子往細胞外運，將鉀離子往細胞內運，因此，為了避免鈉鉀泵對鈉離子流的干擾，本發明在用不同濃度的雪卡毒素染毒細胞的同時，加入烏苯苷溶液，烏苯苷起鈉鉀泵抑制劑的作用。?

作為本發明的進一步改進，所述步驟C）的染毒時間為18?h，與染毒12?h和24?h相比，染毒18?h時標準曲線的確定系數更高。?

作為本發明的進一步改進，所述鈉離子熒光探針為CoroNa^TM?Green，購自Invitrogen公司，貨號為C36676，用平衡鹽溶液（HBSS）稀釋至濃度為5?μmol/L，每孔加入100?μL。CoroNa^TM?Green的激發波長為492?nm，發射波長為516?nm。?

與現有技術相比，本發明的有益效果是：雪卡毒素鈉離子熒光探針檢測法直接檢測雪卡毒素導致的鈉離子流變化，特異性強，能更靈敏地檢測出雪卡毒素，檢測時間由傳統細胞檢測法的24?h縮短為18?h。?

附圖說明

圖?1?為本發明實施例一的標準曲線。?

圖?2?為本發明實施例二的標準曲線。?

圖?3?為本發明實施例三的標準曲線。?

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細說明。?

實施例一：鈉離子熒光探針檢測法檢測雪卡毒素。?