[發明專利]用雙指示線免疫層析半定量診斷甲胎蛋白的方法

無效

• 申請號: 201110148727.0
• 申請日: 2011-06-03
• 公開（公告）號: CN102323425A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 霍五奎;岳曉燕;馬雪明;劉寅;王晶;羅云萍;張有青
• 申請（專利權）人: 正元盛邦(天津)生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/574;G01N33/558
• 代理公司: 暫無信息
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技術領域

本發明涉及一種生物工程技術領域的檢測方法，具體是一種用雙指示線免疫層析半定量診斷甲胎蛋白的方法。

背景技術

肝細胞肝癌(hepatocellular?carcinoma，HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大常見惡性腫瘤。肝癌惡性程度高，發展迅速，其平均患病年齡為44歲，若治療不及時或治療方案選擇不當，平均生存時間為半年。我國每年死于肝癌約11萬人，占全世界肝癌死亡人數的45％，但隨著AFP及其他檢測方法的廣泛應用，肝癌的發病率和檢出率逐漸增高。這表明，未來我國對于高質量的肝癌診斷產品，尤其是AFP診斷產品的需求將越來越大。

對于肝癌來說，一般自身如果出現明顯癥狀，再去檢查的話就已經到了晚期，而且錯過了最好的治療時間。肝癌病人早期基本上無癥狀，一旦出現諸如肝區疼痛、腹脹、腹部包塊、黃疸、腹水等癥狀時，多已屬晚期。肝癌患者很難早期發現，目前接受治療的肝癌病人約3/4就屬于晚期，給治療帶來極大的困難。，患者會感到肝區脹痛，尤其飯后為甚，厭食，肝大，右上腹有腫塊，不明原因的消瘦、腹脹、腹瀉、間斷性發熱、乏力、食欲減退等。因此，早期發現并及時就診成為提高肝癌治愈率的焦點問題，而目前，對于肝癌的早期檢測集中于甲胎蛋白AFP這一特異性蛋白。

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是一種由胎兒肝細胞產生的分子量70kDa左右的胚胎性糖蛋白，出生后其含量在20ng/mL以下，一旦肝細胞發生癌變，則恢復了產生這種蛋白質的功能，血液中AFP含量明顯增高，所以可作為診斷原發性肝癌的指標之一。一般認為AFP含量低于20ng/mL時，沒有臨床意義，大于20ng/mL而小于400ng/mL時，可視為肝細胞異常，在400ng/mL以上時，作為原發性肝癌的確診指標。因此，檢測血清中AFP含量的異常增高，作為早期發現和診斷原發性肝癌，在臨床上是非常有效的判定依據。血清中AFP含量不僅可作為HCC的早期診斷指標，也可作為療效觀察和預后判斷的指標。目前，臨床上常用的AFP檢測的方法為ELISA，CLIA等方法。上述方法費時、費力、不利于普及而且費用昂貴。開發簡單、快速的肝癌早期診斷方法具有十分重要的經濟價值和社會意義。

免疫膠體金技術是20世紀70年代初期由Faulk和Taylor始創，最初用于免疫電鏡技術。膠體金標記技術是以膠體金作為示蹤標志物或顯色劑，于抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術，現在已成功用于電鏡、流式細胞儀、免疫印跡、蛋白染色、體外診斷制劑的制造等領q域。目前金標記技術常與膜載體配合，形成特定的免疫檢測方式，如免疫滲濾試驗和免疫層析試驗等。免疫層析試紙條就是此技術用于體外快速診斷的一個重要發展方向，是在現代單克隆抗體技術、膠體金免疫層析技術和新材料技術基礎上發展起來的新型檢測技術。近年來該技術發展迅速，已經在臨床診斷特別是床邊檢測(POCT)中得到了廣泛應用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測。

目前，已經有很多公司開發出檢測甲胎蛋白的試劑盒，例如藍十字生物藥業(北京)有限公司的甲胎蛋白(AFP)檢測試紙(膠體金法)，重慶泰科華誼醫藥有限公司的甲胎蛋白AFP膠體金診斷試劑等。侯惠仁等人通過實驗研制AFP免疫層析測試條，只需將少量血清滴于測試條上，大約10min后，經目測即能得知AFP的陰陽性。但是對于臨床上肝細胞的異常及肝癌不能區分，單獨使用20ng/mL這一標準不能直接、快速確診肝癌，所以開發能夠檢測AFP?20～400ng/mL這一AFP診斷灰區的半定量膠體金試紙也是十分必要的。目前國內外均無相關的試紙條出售。

發明內容

本發明的目的：開發簡單、快速的甲胎蛋白診斷方法具有十分重要的經濟價值和社會價值。本實驗采用膠體金免疫層析法，建立快速檢測AFP的方法。并且能夠半定量檢測20ng/mL～400ng/mL這一AFP灰區范圍。

本發明是通過以下技術方案實現的：采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標記抗AFP單克隆抗體1并均勻涂布于膠金墊上，作為示蹤標記物。在硝酸纖維素膜上，兩個不同濃度的AFP單克隆抗體2固定于兩個檢測線(即T線)，羊抗鼠二抗固定于質控線(即C線)。依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙并裝入檢測卡中。金標抗體與相應的抗原、抗體發生特異性結合被截留而顯色，根據T線、C線顯色與否來判斷陰陽性結果。

本發明方法包括如下步驟：

一、膠體金溶液配制

1.配制1％氯金酸溶液；

2.配制2％檸檬酸三鈉溶液；