[發明專利]不含基因組DNA的總RNA制備方法

有效

• 申請號: 201110146840.5
• 申請日: 2011-06-02
• 公開（公告）號: CN102286459A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 朱國萍;徐蕾;凌烈鋒;王鵬;曹正宇;宋平;呂俊;靳明明;徐雷雷;裴云云
• 申請（專利權）人: 安徽師范大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C07H21/02;C07H1/06
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產權代理有限公司 34107
• 代理人: 方南

技術領域

本發明涉及一種基于酚抽提的、純化不含基因組DNA的總RNA的方法。

背景技術

隨著生命科學發展進入到后基因組時代，RNA表達模式的研究受到越來越多的重視。許多有關RNA的檢測方法，如逆轉錄PCR(RT-PCR)，Northern印跡法，基因芯片以及高通量RNA測序技術也日趨廣泛應用。獲得高質量、完整且不含其它雜質的總RNA，是應用RNA研究技術的前提。當前，提取RNA有很多種方法，主要歸為兩類。一類是以酚抽提為基礎的方法。這類方法采用變性劑來裂解細胞以及抑制核酸酶，并使用酚抽提來分離核酸。常用的變性劑包括硫氰酸胍(GuSCN)以及十二烷基硫酸鈉(SDS)。硫氰酸胍被認為是最強的變性劑之一，可有效裂解細胞以及抑制核酸酶。P.Chomczynski和N.Sacchi提出的酸性硫氰酸胍-酚-氯仿(Single-step?method?of?RNA?isolation?by?acid?guanidinium?thiocyanate-phenol-chloroform?extraction，P.Chomczynski?and?N.Sacchi，Anal?Biochem?1987，162：156-159)法是目前常用的RNA抽提方法，其采用含有胍鹽的裂解試劑裂解細胞，然后采用酚抽提去除蛋白質等雜質，再使用異丙醇或乙醇沉淀即可得到純化的RNA樣品。此法以及由其發展而來的Trizol試劑，對提取RNA酶豐富的材料中的RNA取得了很大的成功。然而對于一些材料如大腸桿菌和脂肪組織，有報道稱胍鹽裂解的方法不能得到很好的結果。十二烷基硫酸鈉是另一種常用的變性劑，其對于某些材料尤其是細菌，可以迅速裂解細胞并同時抑制RNA酶，結合酚抽提可獲得較好的RNA樣品。另一類方法采用固相吸附。現在很多基于硅膠柱的RNA純化方法都屬于這一類。這類純化方法利用了在胍鹽(硫氰酸胍、鹽酸胍等)存在時，核酸可與硅膠膜材料結合的性質，使RNA結合在硅膠膜上；再使用含乙醇的洗滌液去除雜質；最后使用低鹽溶液(如TE緩沖液)或蒸餾水洗脫純化的RNA。但由于小分子量的RNA的在胍鹽存在時與硅膠膜結合能力較差，這類方法對小分子量的RNA的回收效率較差。

對于現有的方法還存在一個讓研究者困擾的問題，即這些方法本身對于基因組DNA的污染的去除能力較差。由于基因組DNA和RNA的理化性質非常類似，通常的RNA提取方法很難將它們徹底分離。例如，實驗測得直接通過SDS-酚法提取得到的大腸桿菌總RNA每微克樣品約含10⁷到10⁸拷貝(40納克到400納克)的基因組DNA；酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法提取得到的大腸桿菌總RNA每微克樣品約含10⁵拷貝(400皮克)的基因組DNA。一般的硅膠柱法所得到的RNA每微克約含600皮克到200納克的基因組DNA(Agilent公司技術文檔)。然而，諸如RT-PCR以及基因芯片技術需要完全不含基因組DNA的RNA樣品，以避免由于基因組DNA的可擴增性造成對結果的干擾。基因組DNA的去除可以通過DNA酶I(DNase?I)的消化完成。然而用于去除RNA中的DNA所需的DNA酶要求非常高，需要完全不含RNA酶的DNA酶(RNase-free?DNase)，否則將導致RNA樣品的降解，因此價格非常昂貴。DNA酶消化還大大增加了RNA提取的時間。并且在消化過程中，很難實時監測并控制DNA消化的程度。對于不同批次的樣品，酶消化程度的不同可能會造成結果的不確定性。因此，如能開發出一種能在純化步驟中直接去除基因組DNA，而無需DNA酶消化的RNA純化方法，對于提高RNA的研究的效率將是十分有益的。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種能在純化步驟中直接去除基因組DNA，而無需DNA酶消化的總RNA制備方法。

本發明解決技術問題的技術方案為：不含基因組DNA的總RNA制備方法，包括以下步驟：

a)使用重懸液重懸需要提取的生物材料；

b)加入與重懸液體積相同的十二烷基硫酸鈉溶液，室溫裂解3-5分鐘，或65度裂解0.5-1分鐘；

c)加入酸性醋酸鉀溶液，離心，去除出現的沉淀，取上清，醋酸鉀和十二烷基硫酸鈉溶液摩爾比值為1∶0.9-1.1；