[發(fā)明專利]條件表達豬IκBα基因野生型和突變型的DNA片段

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110146482.8
• 申請日: 2011-06-01
• 公開（公告）號: CN102286475A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發(fā)明（設計）人: 楊述林;李和剛;李奎
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/12;C12N15/63;C12N5/10;C07K14/47
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發(fā)明涉及動物基因工程領域，特別涉及一種條件表達豬IκBα基因野生型和突變型的DNA片段。

背景技術

一、IκBα對NFκB信號通路調控及其在延緩性排斥反應中功能的研究進展

NFκB信號通路：通常情況下，NFκB是以同源或異源二聚體形式與IκBα蛋白形成復合物，以非活性形式存在于細胞質中。當受到外界因素刺激時，IκBα第32，36位絲氨酸殘基被IκB蛋白激酶(IKK)磷酸化，磷酸化的IκBα進一步被蛋白酶降解，使NFκB活化，從NFκB-IκBα復合物中解離出并轉位于細胞核，與相應的靶基因結合。

NFκB信號通路在機體生長發(fā)育過程中具有重要功能，所以不宜在機體生長發(fā)育早期就將其阻斷。

IκBα對延緩性排斥反應中NFκB信號通路的調控：將IκBα第32、36位絲氨酸突變成丙氨酸，使IκBα不能被IKK磷酸化、降解，從而抑制NFκB的活化。

二、豬異種移植延緩性排斥反應的機理

在異種移植后幾天至幾周內移植物喪失活性的過程稱為延緩性排斥反應(DXR)。

II型內皮細胞激活是以內皮細胞出現(xiàn)新功能為特征，與DXR的發(fā)生相關，主要造成兩個生理學效應：促炎癥反應和促凝血環(huán)境的形成，這兩種效應都被認為是由NFκB介導的轉錄激活造成的。因此，目前認為通過對供者器官內皮細胞NF-κB的抑制，從而抑制內皮細胞的活化，是較好的抑制DXR的途徑。考慮到IκBα在胚胎、幼年及成年各個時期均具有重要作用，很有必要采用條件性表達技術。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種條件表達豬IκBα基因野生型和突變型的DNA片段。

本發(fā)明提供的表達盒，為雙鏈DNA，自上游至下游依次包括如下元件：啟動子、Loxp序列、IκBα蛋白的編碼基因、終止序列甲、篩選基因、所述Loxp序列、mIκBα蛋白的編碼基因和終止序列乙；所述IκBα蛋白如序列表的序列14所示；所述mIκBα蛋白如序列表的序列15所示。

所述IκBα蛋白的編碼基因(豬IκBα基因野生型)可如序列表的序列1自5’末端第741至1817位核苷酸所示(開放閱讀框為自5’末端第851至1795位核苷酸)。

所述mIκBα蛋白的編碼基因(豬IκBα基因突變型)可如序列表的序列1自5’末端第5125至6201位核苷酸所示(開放閱讀框為自5’末端第5235至6179位核苷酸)。。

所述Loxp序列具體可如序列表的序列1自5’末端第700至733位核苷酸(與序列表的序列1自5’末端第5084至5117位核苷酸相同)所示。

所述終止序列甲和所述終止序列乙具體可為序列表的序列1自5’末端第1840至2067位核苷酸(與序列表的序列1自5’末端第6224至6451位核苷酸相同)所示的pA終止序列。

所述啟動子具體可為序列表的序列1自5’末端第33至693位核苷酸所示的CMV啟動子。

所述篩選基因具體可為序列表的序列1自5’末端第2088至5071位核苷酸所示的TKneo片段的編碼基因。

所述表達盒具體可為如下(a)或(b)：

(a)序列表的序列1自5’末端第33至6451位核苷酸所示的DNA；

(b)序列表的序列1所示的DNA。

所述IκBα基因或所述mIκBα基因末端均可添加各種標簽(如His、HO、c-myc等)。

含有以上任一所述表達盒的重組表達載體也屬于本發(fā)明的保護范圍。

所述重組表達載體的骨架載體可為用于動物的克隆載體或表達載體。

所述重組表達載體具體可為如下(c)或(d)：

(c)在重組質粒pUC19-2的Not?I和Cla?I酶切位點之間插入所述表達盒得到的重組質粒；所述重組質粒pUC19-2是將酶切識別序列乙插入重組質粒pUC19-1的EcoRI和BamH?I酶切位點之間得到的重組質粒；所述重組質粒pUC19-1是將酶切識別序列甲插入pUC19載體的BamH?I和HindIII酶切位點之間得到的重組質粒；所述酶切識別序列甲為將序列表的序列7所示的單鏈DNA和序列表的序列9所示的單鏈DNA經過變性和退火得到的雙鏈DNA；所述酶切識別序列乙為將序列表的序列10所示的單鏈DNA和序列表的序列12所示的單鏈DNA經過變性和退火得到的雙鏈DNA；

(d)在pUC19載體的多克隆位點插入所述表達盒得到的重組質粒。