[發明專利]一種有效保存苦蕎麥愈傷組織的玻璃化超低溫保存方法

有效

• 申請號: 201110144892.9
• 申請日: 2011-05-31
• 公開（公告）號: CN102258008A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 趙鋼;王躍華;劉益麗;林抗雪;孫雁霞;鄔曉勇;馬良良;張玨
• 申請（專利權）人: 成都大學
• 主分類號: A01N3/00
• 分類號: A01N3/00
• 代理公司: 成都科奧專利事務所(普通合伙) 51101
• 代理人: 王蔚

技術領域

本發明涉及一種植物種質資源的超低溫保存技術，特別是涉及一種有效保存苦蕎麥愈傷組織的玻璃化超低溫保存方法。

背景技術

苦蕎麥是集營養、保健、醫療于一體的天然功能食品，加工后經濟效益增值很高。目前，苦蕎麥的種植主要是通過苦蕎麥種子萌發后進行栽種，然而長期的研究發現，苦蕎麥種子在保存過程中存在著種子老化的問題，表現為發芽率逐年降低，對苦蕎育種十分不利，也對其種質資源的保存相當不利。

超低溫保存是現代生物技術的一項主要內容，同時也是植物種質保存技術中較為理想的方法，利用植物的某些組織部位進行的超低溫保存及其種質庫的建立日益受到人們的重視。超低溫保存可長期保存植物的種質資源，特別是對一些稀有、珍貴和頻危植物資源的保存具有極其重要的意義。

目前運用最多的超低溫保存方法是玻璃化法超低溫保存，所謂“玻璃化”就是將細胞或組織置于由一定比例的滲透性和非滲透性保護劑組成的高濃度的玻璃化溶液中，使細胞及其高濃度玻璃化溶液在足夠快的降溫速率下過冷到玻璃化轉變溫度，從而被固化成玻璃態(或非晶態)，并以這種玻璃態在超低溫下保存。在玻璃化法超低溫保存中起關鍵作用的是玻璃化保護劑的運用，玻璃化保護劑的濃度和種類對種質資源的保存有著直接的影響，如果保護劑濃度過高，在裝載和脫水過程中細胞可能會由于嚴重的脫水造成細胞的存活率降低甚至細胞死亡；如保護劑濃度過低，植物細胞可能會脫水不充分，含水量較高，同時進入細胞內的保護劑較少，細胞內液濃度較低，在超低溫保存過程中細胞內溶液很難形成玻璃態，大部分形成冰晶，對細胞內部結構造成嚴重的傷害，造成細胞存活率較低。同時，選擇適當種類的保護劑也相當重要，不同保護劑的滲透力和對保存細胞的毒性存在較大的差異。

材料的洗滌是決定保存后材料成活率高低的直接因素，洗滌是為了除去高濃度的冰凍保護劑對材料的進一步傷害，因此采用適當的濃度及種類是至關重要的。傳統的洗滌方式常采用MS+蔗糖1.2mol/L溶液對保存后的材料進行洗滌，通常分三步洗滌，每步10分鐘，但大量試驗研究結果顯示，此種方法對苦蕎麥愈傷組織的保存效果不佳，保存后細胞的存活率不高。

發明內容

本發明的目的在于提供一種有效保存苦蕎麥愈傷組織的玻璃化超低溫保存方法，該方法對所保存的愈傷組織傷害較小，能明顯提高愈傷組織的存活率。

為達到上述目的，本發明采用的解決方法包括如下步驟：

(1)預培養：取苦蕎麥的愈傷組織，置于裝有培養液的冷凍管中，在常溫下預培養1天，所述培養液按每升計含：二甲基亞砜50mL+山梨醇0.4mol；

(2)裝載：取預培養1天后的愈傷組織置于裝有裝載液的冷凍管中，在4℃裝載處理20～60分鐘，所述裝載液由濃度為0.5mol/L的蔗糖溶液與玻璃化溶液按體積比40：60配制而成，所述玻璃化溶液按每升計含：蔗糖1.0mol+山梨醇0.2mol+聚乙二醇100g+1，2-丙二醇溶液100mL；

(3)脫水：取裝載后的愈傷組織置于裝有玻璃化溶液的冷凍管中，在0℃脫水處理40～80分鐘，所述玻璃化溶液按每升計含：蔗糖1.0mol+山梨醇0.2mol+聚乙二醇100g+1，2-丙二醇溶液100mL；

(4)冷凍保存：將脫水處理后的上述冷凍管迅速投入液氮中進行超低溫保存；

(5)解凍及洗滌：當需要使用愈傷組織時，將冷凍管從液氮中取出，將其迅速放入30～50℃的水浴中進行解凍處理，解凍完成后迅速去掉玻璃化溶液，并采用三步梯度洗滌法進行洗滌，首先采用每升含：牛血清蛋白30g+蔗糖1.0mol+山梨醇0.5mol的洗滌液洗滌10分鐘，再用每升含：牛血清蛋白30g+蔗糖0.5mol+山梨醇1.0mol的洗滌液洗滌10分鐘，最后使用每升含：牛血清蛋白30g+蔗糖0.5mol的洗滌液洗滌10分鐘。

解凍后的愈傷組織細胞的存活率可通過如下方法進行檢測：將洗滌后的愈傷組織放入燒杯中，加入適量的2，3，5-氯化三苯基四氮唑溶液，即TTC溶液，于25℃恒溫暗處染色18小時后，吸去TTC溶液，加入95％(濃度)的乙醇于40℃恒溫水浴鍋中進行三苯基甲月替的提取直至材料顯示無色，取其提取的上清液用UV-1100型紫外/可見分光光度計在485nm處測定其吸光值，并計算凍后材料細胞相對存活率，細胞相對存活率％＝處理后材料的吸光值/未處理材料的吸光值X?100％。所采用的TTC溶液是用TTC物質在pH為7.0的磷酸緩沖溶液中配制而成的，配制濃度為0.4％。