[發明專利]一種有效保存苦蕎麥愈傷組織的玻璃化超低溫保存方法

有效

• 申請號: 201110144892.9
• 申請日: 2011-05-31
• 公開（公告）號: CN102258008A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 趙鋼;王躍華;劉益麗;林抗雪;孫雁霞;鄔曉勇;馬良良;張玨
• 申請（專利權）人: 成都大學
• 主分類號: A01N3/00
• 分類號: A01N3/00
• 代理公司: 成都科奧專利事務所(普通合伙) 51101
• 代理人: 王蔚

1.一種有效保存苦蕎麥愈傷組織的玻璃化超低溫保存方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)預培養：取苦蕎麥的愈傷組織，置于裝有培養液的冷凍管中，在常溫下預培養1天，所述培養液按每升計含：二甲基亞砜50mL+山梨醇0.4mol；

(2)裝載：取預培養1天后的愈傷組織置于裝有裝載液的冷凍管中，在4℃裝載處理20～60分鐘，所述裝載液由濃度為0.5mol/L的蔗糖溶液與玻璃化溶液按體積比40∶60配制而成，所述玻璃化溶液按每升計含：蔗糖1.0mol+山梨醇0.2mol+聚乙二醇100g+1，2-丙二醇溶液100mL；

(3)脫水：取裝載后的愈傷組織置于裝有玻璃化溶液的冷凍管中，在0℃脫水處理40～80分鐘，所述玻璃化溶液按每升計含：蔗糖1.0mol+山梨醇0.2mol+聚乙二醇100g+1，2-丙二醇溶液100mL；

(4)冷凍保存：將脫水處理后的上述冷凍管迅速投入液氮中進行超低溫保存；

(5)解凍及洗滌：當需要使用愈傷組織時，將冷凍管從液氮中取出，將其迅速放入30～50℃的水浴中進行解凍處理，解凍完成后迅速去掉玻璃化溶液，并采用三步梯度洗滌法進行洗滌，首先采用每升含：牛血清蛋白30g+蔗糖1.0mol+山梨醇0.5mol的洗滌液洗滌10分鐘，再用每升含：牛血清蛋白30g+蔗糖0.5mol+山梨醇1.0mol的洗滌液洗滌10分鐘，最后使用每升含：牛血清蛋白30g+蔗糖0.5mol的洗滌液洗滌10分鐘。