[發明專利]適用于作物SSR分子標記分析的基因組DNA提取方法

有效

• 申請號: 201110144544.1
• 申請日: 2011-05-31
• 公開（公告）號: CN102220313A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發明（設計）人: 梁俊;李楊瑞;陳忠良;莫磊興;吳凱朝;范業賡;王天順;牙禹;廖潔;魏源文;鄧智年;莫璋紅
• 申請（專利權）人: 廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室;農業部甘蔗品質監督檢驗測試中心（南寧）
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體地說，涉及一種適用于作物SSR分子標記分析的基因組DNA提取方法。

背景技術

傳統的常規育種方法工作量大、育種周期長、效率低，消耗大量人力物力，難以滿足對選育優良品種的要求。目前，利用分子標記技術進行輔助育種已成為一種趨勢。許多分子標記表現為共顯性，可以鑒別出純合基因型和雜合基因型，可提供較為完整的遺傳信息。分子標記技術直接以遺傳物質DNA形式表現，不受物種的組織類別、發育階段等影響，不受季節、環境等限制。分子標記輔助育種促使育種工作更便利，效率更高，結果更準確可靠。

植物基因組DNA提取是分子標記技術操作的關鍵步驟之一。目前，常用的植物基因組DNA提取方法主要有CTAB法、SDS法和高鹽法及其改良方法；這些方法一般步驟為：使用液氮或機械研磨材料，加入DNA提取緩沖液于65℃裂解細胞、釋放DNA，后經酚、氯仿和異戊醇等抽提多糖類、蛋白質等雜質來純化DNA，之后使用無水乙醇或異丙醇沉淀DNA，最后晾干DNA和溶解DNA。操作過程較為繁瑣，耗時多，生產效率低，成本高。

因此，尋找一種簡便、快速、能夠滿足SSR分子標記技術要求的作物基因組DNA提取方法成為亟待解決的問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種簡便、快速、高通量、成本低的適用于作物SSR分子標記分析的基因組DNA提取方法。

為了實現本發明目的，本發明的一種適用于作物SSR分子標記分析的基因組DNA提取方法，包括步驟：

1)向葉片中加入DNA提取緩沖液，蛋白酶K和核糖核酸酶，振蕩混勻；

2)將上述混合體系置于37℃，30min；68℃，20min；37℃，30min；然后于4℃保存；

3)將步驟2)中得到的混合體系快速轉置于冰上冰浴5-10min；

4)將步驟3)中得到的混合體系離心，得上清。

前述的基因組DNA提取方法，步驟1)具體為：向0.02～0.04cm²的葉片中加入50～100μLDNA提取緩沖液，0.2～0.4μL的100mg/mL蛋白酶K和1～2μL的10mg/mL核糖核酸酶，振蕩混勻10～20sec；

其中，DNA提取緩沖液的成份為10mmol/L?Tris-HCl，1mmol/LEDTA，0.1％SDS，pH值8.0。

優選地，步驟1)為：向0.02～0.04cm²的葉片中加入50μL?DNA提取緩沖液，0.2μL的100mg/mL蛋白酶K和1μL的10mg/mL核糖核酸酶，振蕩混勻10sec。

前述的基因組DNA提取方法，步驟2)為混合體系置于PCR擴增儀中進行反應。

前述的基因組DNA提取方法，步驟4)為4℃下3000～5000rpm離心10～15min，優選地，4℃下3000rpm離心10min。

前述的基因組DNA提取方法，所述作物為甘蔗、水稻、玉米、大豆或花生等。

本發明至少具有下列優點及有益效果：

(一)本發明所述的基因組DNA提取方法不需要研磨樣品，無需抽提蛋白質、沉淀DNA、洗滌DNA和溶解DNA，所用的試劑少，提取成本低。

(二)本發明所述的DNA提取方法可使用96孔PCR板裝載反應物，具備高通量特性，可在短時間內完成大批量樣品DNA的提取。

(三)本發明所述的DNA提取方法僅有4個操作步驟，簡單易行。

(四)本發明所述的DNA提取方法為“單管制備DNA模板”，提取過程中不需要轉換存放基因組DNA的器皿，避免交叉污染，做到DNA模板質量無污染。

(五)本發明所述的DNA提取方法適用范圍較廣，提取甘蔗、水稻、玉米、大豆和花生等作物的基因組DNA的質量較好，可以滿足SSR分子標記分析。

附圖說明

圖1為采用本發明方法提取甘蔗、水稻、玉米、大豆和花生基因組DNA的0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，1～2為甘蔗品種湛江25號、ROC20，3～4為水稻品種博優168、金優桂99，5～6為玉米品種正大619、桂糯518，7～8為大豆品種桂春豆1號、桂早2號，9～10為花生品種桂花26、桂花30。