[發明專利]快速檢測阪崎腸桿菌的方法

有效

• 申請號: 201110143730.3
• 申請日: 2011-05-31
• 公開（公告）號: CN102323408A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 趙渝;陳艷;黃慧心;郭魯申
• 申請（專利權）人: 上海師范大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/531;G01N24/08
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 吳瑾瑜

技術領域

本發明涉及微生物檢測領域，尤其是食源性微生物檢測領域，公開了一種以核磁共振方法檢測生物功能化超順磁納米粒子免疫識別目標微生物，實現高靈敏檢測阪崎腸桿菌的方法。

背景技術

許多食源性疾病大多都是由食源性致病菌引起的。食源性致病菌快速檢測一直是研究關注的焦點。食源性致病菌快速檢測是采用微生物學、化學、生物化學、生物物理、免疫學的方法對食品及其加工、貯藏等環境中的致病菌進行分離、檢測、鑒定和計數。

阪崎腸桿菌是乳制品中新發現的一種病原菌，已被世界衛生組織和許多國家確定為引起嬰幼兒死亡的重要條件致病菌。阪崎腸桿菌(又稱阪崎氏腸桿菌)是腸桿菌科的一種，1980年由黃色陰溝腸桿菌更名為阪崎腸桿菌。該菌引起的食源性疾病可導致嬰兒(尤其是新生兒)的腦膜炎、小腸結腸炎和菌血癥，報告病例的死亡率達20％～50％，幸存者常遺留嚴重的神經系統疾病。

近年來對食品(奶粉、巧克力、谷類食品、馬鈴薯、意大利面等)加工廠原料、生產環境及家庭中阪崎腸桿菌污染率的研究發現，阪崎腸桿菌在自然界中分布廣泛。在多起阪崎腸桿菌的暴發事件中發現，新生兒阪崎腸桿菌感染與嬰兒配方粉(powdered?infant?formula，PIF)密切相關。2004年2月FAOPWHO在日內瓦召開的嬰兒配方粉中阪崎腸桿菌專家研討會上提出，嬰兒配方粉中微量的阪崎腸桿菌污染(＜3CFUP100g)也能導致感染的發生。即使是嬰兒配方粉中大腸菌群污染水平符合相應的微生物學標準，也可能存在阪崎腸桿菌的污染。PIF中阪崎腸桿菌的污染已經引起國際社會的廣泛關注。2002年國際食品微生物標準化委員會(ICMSF)把阪崎腸桿菌列為“嚴重危害特定人群，危害生命或慢性實質性后遺癥或長期影響”的一種致病菌。

從2005年開始我國陸續出臺了阪崎腸桿菌檢測的行業標準和國家標準。雖然標準規定的檢測方法準確性和靈敏度較高，但存在操作繁瑣、時間長等缺陷。分子技術比如PCR技術應用于阪崎腸桿菌的檢測，用PCR技術檢測有害微生物具有特異性強、靈敏度高和操作簡便、省時等優點，但是PCR反應受樣品情況的影響比較大，特別在食源性有害微生物檢查中，食品中的成分(糖類、酸類，油脂等物質)會干擾反應的正常進行。而檢測的環境，中間處理環節也會帶來一些PCR反應抑制劑。從而使PCR反應呈現較高的假陽性和假陰性率。

近年來，隨著科技的發展，納米技術和核磁共振技術的發展趨勢與前景越來越廣泛，應用范圍也趨于多樣化。在靜磁場中，具有磁性的原子核存在不同能級。用一特定頻率的電磁波(射頻場)照射樣品，當電磁波能量等于能級差時，原子核吸收電磁波發生能級躍遷，產生共振吸收信號，此即核磁共振。核磁共振(NMR)技術就是利用高磁場中原子核對射頻輻射的吸收光譜來鑒定化合物結構的分析技術。

核磁共振技術目前已經應用的有：細菌、酵母、絲狀真菌、支原體等多種微生物的代謝研究；酒類樣品的質量鑒定；肉類樣品的質量檢驗；食品中污染物的分析；核磁共振磷譜³¹P?NMR與HPLC聯用篩選高效有機磷降解細菌；食品中農藥殘留物的分析測定等。核磁共振技術具有與其他方法相比較的獨特優點：(1)對樣品沒有損傷性，它并不破壞樣品的結構和性質，無輻射損傷；(2)只需簡單預處理(不必進行提取分離)就可以同時測定多種成分；(3)定量測定不需標定(4)分析速度與精密度接近于高效液相色譜法；(5)實驗方法靈活多樣。所以核磁共振技術在食品中的應用和發展也越來越趨于廣泛。

為了食品安全，為了尋求更簡便、快速、靈敏的食源性致病菌的檢測方法，為了替可能出現的食品安全問題提供應對方法，需要對現有的檢測方法進行改進。

發明內容

本發明旨在提供一種快速檢測阪崎腸桿菌的方法。

這種快速檢測阪崎腸桿菌的方法，包括如下步驟：

(1)向待測的樣品中加入免疫化超順磁性納米磁珠和穩定劑，30～40℃孵育45～60分鐘；

(2)將步驟(1)混合物加入核磁管中，測定自旋-自旋弛豫時間，以不含菌的樣品為空白對照，計算ΔT₂值；

所述的穩定劑為牛奶，在混合體系中質量含量為1～3％；

所述的免疫化超順磁性納米磁珠是以四氧化三鐵納米粒子為內核、以二氧化硅為外殼、表面偶聯抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的磁性粒子。

優選的，抗阪崎腸桿菌多克隆抗體為兔抗阪崎腸桿菌多克隆抗體。

免疫化超順磁納米磁珠的粒徑為80～120nm，用量為0.5～0.1mg/ml。