[發明專利]丙型肝炎病毒多表位肽負荷的樹突狀細胞治療性疫苗

有效

• 申請號: 201110143410.8
• 申請日: 2011-05-31
• 公開（公告）號: CN102210861A
• 公開（公告）日: 2011-10-12
• 發明（設計）人: 賈戰生;周云;潘蕾;李端
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;G01N33/576;G01N33/569;C12N15/861;A61P1/16;A61P31/14
• 代理公司: 西安吉盛專利代理有限責任公司 61108
• 代理人: 張培勛

1.丙型肝炎病毒多表位肽負荷的樹突狀細胞治療性疫苗，其制備方法是：由含GFP標簽的HCV?2個CTL表位的重組腺病毒，感染人DC所獲得，所述2個CTL表位為NS4B(1793-1801)?SMMAFSAAL和P7(774-782)?AAWYIKGRL。

2.丙型肝炎病毒多表位肽負荷的樹突狀細胞治療性疫苗，其制備方法是：由含序列1的重組腺病毒，感染人DC所獲得。

3.如權利要求1或2所述的樹突狀細胞疫苗的制備方法。

4.一種重組腺病毒，其含GFP標簽的HCV?2個CTL表位，所述2個CTL表位為NS4B(1793-1801)?SMMAFSAAL和P7(774-782)?AAWYIKGRL。

5.丙型肝炎病毒多表位肽負荷的樹突狀細胞治療性疫苗，其特征是:將CTL表位?NS4B(1793-1801)?SMMAFSAAL和P7(774-782)?AAWYIKGRL用于構建重組腺病毒，進而采用該病毒感染人樹突狀細胞來制備多表位樹突狀細胞疫苗。

6.根據權利要求1所述的丙型肝炎病毒多表位肽負荷的樹突狀細胞治療性疫苗，其特征是：所述的重組腺病毒表達：重組腺病毒表達質粒AD-序列1和AD-序列2構建:由上海合成序列1?in?pGH和序列2?in?pGH；序列1為HCV的CTL表位?NS4B(1793-1801)?SMMAFSAAL和P7(774-782)?AAWYIKGRL加上HCV?Th表位NS3（1248-1261）GYKVLVLNPSVAAT串聯，表位中間由促進表位提呈的AAY連接，應用兼顧pichia酵母偏性密碼子和大腸桿菌偏性密碼子設計基因，人工合成HCV?CTL雙表位基因串聯；序列2為陽性對照，包含HCV的CTL表位Core(35-44)YLLPRRGPRL,?Core(132-140)DLMGYIPLV和HCV?Th表位NS3（1248-1261）GYKVLVLNPSVAAT；序列1和2同時加上GFP和FLAG標簽，有利于Western?Blot檢測目的多肽的表達。

7.根據權利要求5所述的丙型肝炎病毒多表位肽負荷的樹突狀細胞治療性疫苗，其特征是：所述的樹突狀細胞的培養：全血來自于健康供者，經Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC），按CD14?MicroBeads?humanmonocyte?kit(MACS)?操作說明，分離收集CD14+單核細胞，細胞純度達96.32%；用無血清培養液X-VIVO15調整CD14+單核細胞密度為1×10⁶cells/mL接種于24孔板，5%C02、37℃?孵育培養5天，隔日半量換液，并加入GM-CSF(1000U／ml)?和IL-4?(?1000U／ml?)，第5天起加入成熟誘導因子rTNF-α（10ng/mL）、IL-1β（10?ng/mL）、IL-6（10?ng/mL）、PGE2（1μg/mL）培養2天，即可誘導出成熟的樹突狀細胞；在倒置顯微鏡下觀察,培養1?d?后大部分細胞仍貼壁生長并成簇排列,呈圓形,細胞膜光滑無突起；培養5?d?后,細胞的形態出現不規則,懸浮細胞逐漸增多,細胞伸出突起；培養7d后,胞體明顯變大,絕大部分細胞呈半懸浮生長,可見胞體不規則增大,胞膜向外伸出樹枝樣突起。

8.根據權利要求5所述的丙型肝炎病毒多表位肽負荷的樹突狀細胞治療性疫苗，其特征是：所述樹突狀細胞疫苗的免疫原性檢測：

1）混合淋巴細胞培養；

2）ELISA檢測DC上清IL-12p70和混合淋巴細胞培養上清IFN-γ；

3）用LDH釋放法檢測CTL活性。

9.根據權利要求1所述的丙型肝炎病毒多表位肽負荷的樹突狀細胞治療性疫苗，?其特征是:所述的重組腺病毒構建了HCV多CTL表位肽負荷的樹突狀細胞（DC）治療性疫苗。