[發明專利]溶腫瘤能力增強的B型人腺病毒Ad11突變體的構建和應用

有效

• 申請號: 201110143385.3
• 申請日: 2011-05-31
• 公開（公告）號: CN102260712A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 王堯河;姜國忠;黃漢熙;曹風雨;尼克萊蒙
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/09;C12N7/00;C12N15/64;C12Q1/02;G01N21/64;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 張愛軍

1.一種B型重組人腺病毒載體Ad11-5EP的構建方法，其特征是：利用同源重組將Ad5?E1A編碼序列上游的365bp段基因，包括Ad5?E1A的增強子和啟動子，置換到B型人腺病毒11亞型Ad11的相應區域，構建成B型重組人腺病毒載體Ad11-5EP。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征是：所述同源重組時，左臂序列是Ad11基因組前392bp段基因，右臂為Ad5?E1A?增強子及啟動子序列的195-559bp段基因和?Ad11?E1A?的568-1125bp段基因，按順序連接到一起形成片段，左臂和右臂分別連接到pSS-ChI兩側多克隆位點上，建立穿梭載體pSS-A1A7；pSS-A1A7被PmeI酶切并純化，PmeI消化片段同時與pAd11在BJ5183細胞內進行同源重組，然后在含氨芐青霉素及氯霉素兩種抗生素的瓊脂板上篩選；陽性克隆分別經SwaI酶切，移除抗氯霉素基因表達盒序列，生成pAd11-Ad5EP，pAd11-Ad5EP經NotI酶切線性化后，轉染到293細胞中產生腺病毒Ad11-5EP。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征是：所述氨芐青霉素、氯霉素的濃度分別為100mg/ml、25mg/ml。

4.利用權利要求1所述的B型重組人腺病毒載體Ad11-5EP改造復制選擇性溶腫瘤腺病毒的方法為下列方法其中之一：

(1)刪除腺病毒在正常細胞中生存必需但在腫瘤細胞中不需要的基因E1A?CR2區域或抗凋亡基因E1B?21K；

(2)插入腫瘤特異啟動子，驅動E1A基因的表達；

(3)根據腫瘤細胞表面特異受體，改造腺病毒的嗜細胞性；

(4)結合MicroRNA技術，賦予病毒選擇性地在腫瘤細胞中進行復制。

5.一種B型重組人腺病毒載體Ad11-5ETel-GFP的構建方法，其特征是：所述方法包括以下步驟：

（1）先用兩個不同的抗生素抗性表達盒構建載體pSS-ChI?和pSS-kna，在抗氯霉素基因表達盒序列兩側引入SwaI酶切位點，在抗卡那霉素基因表達盒序列兩側引入sbfI酶切位位點；

（2）從pUC18克隆得到pBR32復制的起始序列，通過人工合成的包含多克隆位點的核苷酸序列與抗氯霉素基因表達盒序列相連接產生pSS-ChI，同源重組抗氯霉素基因表達盒序列上游左臂序列和下游右臂序列，將抗氯霉素上游左臂序列和下游右臂序列分別平端或粘端插入到pSS-ChI兩側的多克隆位點內，構建重組用的穿梭載體；

（3）從pUC18克隆得到pBR32復制的起始序列，通過人工合成的包含多克隆位點的核苷酸序列與抗卡那霉素基因表達盒序列相連接產生pSS-kna，同源重組抗卡那霉素基因上游左臂序列和下游右臂序列，將抗卡那霉素基因上游左臂序列和下游右臂序列分別平端或粘端插入到pSS-kna兩側的多克隆位點內，構建重組用的穿梭載體；

（4）pSSENTel的構建，左臂序列是Ad11基因組的前392bp序列，右臂為Ad5?E1A?增強子的195-378bp段基因、人?TERT?啟動子的-714-0bp段基因?和?Ad11?E1A的568-1125bp序列按順序連接在一起形成的片段，同時在人?TERT?啟動子的兩側分別引入兩個限制性酶切位點XbaI?和NcoI，左臂和右臂分別平端插入到pSS-ChI的相應兩側SnabI和EcoRV，最終生成pSSENTel；

（5）pSSGFP的構建，左臂為Ad11?基因組從27301?到?27837bp的DNA片段與EGFP基因通過NcoI的連接產物，并在EGFP的3’處引入SnaBI位點；右臂是Ad11?基因組從28337?到?28920bp的DNA片段，左臂和右臂分別平端插入到pSS-kna兩側的SnabI和EcoRV位點，最終生成pSSGFP；

（6）pSSENTel和pSSGFP分別被PmeI酶切并純化，兩個PmeI消化片段同時與pAd11在BJ5183細胞內進行同源重組，然后在含氨芐青霉素、卡那霉素及氯霉素三種抗生素的瓊脂板上進行篩選；陽性克隆分別經SwaI?和?SbfI酶切，移除抗氯霉素基因表達盒序列和卡那霉素基因表達盒序列，生成pAd11-5ETel-GFP；pAd11-5ETel-GFP經NotI酶切線性化后，轉染到293細胞中產生腺病毒Ad11-5ETel-GFP。