[發明專利]溶腫瘤能力增強的B型人腺病毒Ad11突變體的構建和應用

有效

• 申請號: 201110143385.3
• 申請日: 2011-05-31
• 公開（公告）號: CN102260712A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 王堯河;姜國忠;黃漢熙;曹風雨;尼克萊蒙
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/09;C12N7/00;C12N15/64;C12Q1/02;G01N21/64;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 張愛軍

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技術領域

本發明涉及腺病毒載體及其應用，特別是涉及B型重組人腺病毒載體Ad11-5EP和Ad11-5ETel-GFP的構建方法及其應用。

技術背景

近年來，腫瘤病毒治療特別是腺病毒在腫瘤治療方面的應用發展非常迅速。2005年，E1B?55K和E3B缺陷型腺病毒(H101)首次在中國被批準用于治療頭頸部腫瘤，然而，腺病毒來源的H101對某些惡性腫瘤的療效很差，比如發病高致死性強的胰腺癌。限制腫瘤療效的原因之一是這些腫瘤低表達腺病毒受體(CAR)，而且，靜脈注射的腺病毒很快被抗體及補體中和而滅活，此外，腺病毒還可以被Kuffer細胞吞噬，病毒hexon蛋白與凝血因子X結合，然后轉導肝細胞，所以過量腺病毒容易導致明顯的肝細胞毒性及肝損傷。

Ad11?是B型人腺病毒的一種亞型。在溶腫瘤治療方面，Ad11明顯優越于Ad5。除了CD46受體外，Ad11還可以結合其他細胞表面受體X。Tuve等報道Ad11是B腺病毒亞群中唯一的既結合CD46又結合X的病毒，說明Ad11可以感染更廣范的腫瘤細胞，由此解決了Ad5應用中病毒受體下調而導致感染率低的難題。Ad11較Ad5另外一個優越之處在于人群中Ad11的中和抗體較低為10-31％，?Ad5是45-90％，并且中間無交叉活性。當靜脈注射Ad11到表達CD46的轉基因鼠時，未發現明顯的肝內轉導和肝毒性現象。而且，Ad11能夠高效轉導樹突狀細胞，因此重組Ad11可以表達腫瘤特異抗原，通過增強免疫反應來更好的用于腫瘤免疫治療。

關于Ad5以外的其它腺病毒血清型作為疫苗或基因轉換載體的應用已經有了大量報道。但它們作為溶腫瘤病毒的研究才剛剛起步，相關報道也不深入。Sandberg等最近體內外研究顯示，Ad11能夠有效地在前列腺癌細胞系PC-3中轉導、復制并裂解，但該作者沒有與通用的Ad5進行比較。Shashkova等應用人腫瘤細胞系體外試驗及人前列腺癌細胞系DU?145體內研究，比較了Ad5、Ad6、Ad11和Ad35之間的溶腫瘤效率，發現Ad5、Ad6和Ad11有相似的抗腫瘤效果，而Ad35則無抗腫瘤作用。重要的是，僅僅Ad5產生了肝臟毒性。后來人們因此建立了嵌合型溶腫瘤Ad5(將Ad5的纖毛替換成B亞群腺病毒的)，目的是使嵌合型溶腫瘤Ad5通過結合細胞膜上CD46受體來提高抗腫瘤效果。但是與完整的B亞群腺病毒相比較，這種方法仍不能克服針對Ad5?hexon抗體的中和能力。

循環腫瘤細胞（Circulating?tumour?cells,CTCs）數與腫瘤患者的臨床分期、療效及短的生存率相關。腫瘤患者外周血液的CTCs水平可作為監控和調整治療及判斷預后的依據。這就迫切需要一種特異的、敏感的方法去檢測這些細胞。近年來，免疫細胞計數分析和定量PCR等方法的應用已經能夠在血液中檢測出少量的CTCs，然而缺少特異的生物學標志物及高額的檢測費用限制了這些方法的普及應用。

復制選擇性溶腫瘤腺病毒是一類新的腫瘤治療藥物。值得注意的是，最近已經報導用表達GFP的復制選擇性溶腫瘤腺病毒Ad5在上億外周血細胞中檢測CTCs。然而，腫瘤細胞的遺傳性變化是影響腺病毒感染的重要因素，腫瘤細胞中低表達CAR會顯著降低Ad5的感染能力，進而影響腫瘤細胞的陽性檢出率。并且發現，除了已知的影響機制如CAR低表達以外，另外一些腫瘤相關基因如CEACAM6也能影響Ad5進入到細胞核中，進而減少了Ad5對腫瘤細胞的感染能力。這些數據表明在一些腫瘤細胞中用Ad5檢測CTCs的方法可能敏感性較低。

發明內容

本發明要解決的技術問題：提供一種具有腫瘤靶向性和抗腫瘤效果的腺病毒載體Ad11-5EP，還提供一種用于治療腫瘤或檢測血循環中腫瘤細胞的B型重組人腺病毒載體Ad11-5ETel-GFP。

本發明的技術方案：

發明人首次在人腫瘤細胞系中體外比較了Ad11和Ad5的抗腫瘤潛能，發現在25個被檢細胞系中僅僅有9個對Ad11敏感。其中PC-3對Ad5不敏感而對Ad11敏感。與Ad5相比較，Ad11在體內明顯抑制PC-3細胞的皮下腫瘤生長，并且提高了荷瘤動物的無瘤率。同樣，用對Ad5敏感而對Ad11不敏感的MIA?PaCa-2細胞重復上述實驗，Ad11的抗腫瘤能力明顯降低。