[發(fā)明專利]用于鑒定芽孢桿菌的通用引物以及使用它們的分類方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110142323.0
• 申請(qǐng)日: 2011-05-30
• 公開（公告）號(hào): CN102226216A
• 公開（公告）日: 2011-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬平;李社增;郭慶港;鹿秀云;李寶慶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 胡長(zhǎng)遠(yuǎn)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于芽孢桿菌鑒定分類方法。具體涉及用于鑒定芽孢桿菌的通用引物，以及利用它們對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行分類鑒定的方法

背景技術(shù)

芽孢桿菌(Bacillus)是一類廣泛存在于自然界、能形成芽孢的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。不同種類的芽孢桿菌對(duì)人類的作用是不同的，有些是有益的，如某些枯草芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌可以產(chǎn)生用于作物病害生物防治的抑真菌物質(zhì)，地衣芽胞桿菌可以產(chǎn)生工業(yè)所需的酶類，蘇云金芽孢桿菌(BT)可以產(chǎn)生可作為微生物殺蟲劑的毒性蛋白。而有些則是有害的，如炭疽芽胞桿菌能引起人類致死的炭疽病；蠟樣芽孢桿菌可以污染食品從而引起人類腹瀉。因此，在應(yīng)用之前對(duì)于芽孢桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確分類十分重要。

芽孢桿菌屬(Bacillus)中的有些種之間親緣關(guān)系較近，形態(tài)特征相似，如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)，短小芽孢桿菌(B.pumilus)，巨大芽孢桿菌(B.megaterium)，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(B.firmus)，蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)，蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)或炭疽芽胞桿菌(B.anthracis)等(Porwal等.PLoS?One2009(4)，4438)，利用現(xiàn)有方法有時(shí)難以進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。

芽孢桿菌的分類鑒定方法主要有：(1)形態(tài)和生理生化方法，此種方法因不同芽孢桿菌種之間形態(tài)和生理生化特征比較相似而難以對(duì)它們進(jìn)行區(qū)分，存在準(zhǔn)確度不高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)(Ash，C等.Letters?in?Applied?Microbiology.1991.13，202-206)。(2)16S?rDNA序列對(duì)比方法，由于不同種的芽孢桿菌之間16S?rDNA序列相似性極高(＞98％)，對(duì)有些芽孢桿菌很難進(jìn)行準(zhǔn)確地歸類。(3)RAPD和AFLP擴(kuò)增標(biāo)記對(duì)比方法，此方法均存在操作復(fù)雜或分類結(jié)果不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)(Levy，H.等.(2010).The?Challenge?of?Highly?PathogenicMicroorganisms?191-198.Tourasse，N.J.等.(2010).FoodMicrobiology)。(4)利用gyrA、gyrB或rpoD基因等芽孢桿菌中普遍存在的、序列變異程度較高的基因進(jìn)行鑒定分類(Chelo，I.M.等.International?journal?of?systematicand?evolutionary?microbiology.2007.57，276。Meintanis，C.等.Letters?in?applied?microbiology.2008.46，395-401)。其中g(shù)yrB基因已被廣泛地用于芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析和菌株鑒定(Bavykin，S.G.等.Journal?of?Clinical?Microbiology.2004.42，3711)，但該基因不能準(zhǔn)確地將蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)和蠟樣芽孢桿菌區(qū)分(B.cereus)(Wang，L.T.等.International?journal?of?systematic?and?evolutionarymicrobiology.2007.57，1846)。從上述可知，到目前為止，還沒有一種能將所有的芽孢桿菌種區(qū)分的方法，導(dǎo)致有些芽孢桿菌種之間難以區(qū)分，限制了有益芽孢桿菌的應(yīng)用或?qū)τ泻ρ挎邨U菌缺少明確的認(rèn)識(shí)。

phoR和phoP(亦表示為：phoP/phoR)是芽孢桿菌中普遍存在的一個(gè)雙因子調(diào)控系統(tǒng)，其中phoR基因全長(zhǎng)1737bp，編碼一種組氨酸蛋白激酶，phoP基因全長(zhǎng)720bp，編碼一種受體蛋白，兩個(gè)基因之間存在8bp的重疊序列。在低磷環(huán)境下，phoR自身磷酸化并且將獲得的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到phoP上，磷酸化的phoP調(diào)控下游基因的表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明人從枯草芽孢桿菌NCD-2菌株中克隆出phoP和phoR基因，在進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)意外發(fā)現(xiàn)，在芽孢桿菌屬內(nèi)不同種的菌株之間phoP/phoR雙因子調(diào)控系統(tǒng)基因序列(指phoP和phoR兩個(gè)基因的全序列)存在較高的變異性，因此，本發(fā)明人提出將phoP/phoR雙因子調(diào)控系統(tǒng)內(nèi)部的部分核苷酸序列用于芽孢桿菌的鑒定分類，本發(fā)明中用“phoPR”或“phoPR基因”來(lái)表示所述的phoP/phoR雙因子調(diào)控系統(tǒng)的部分核苷酸序列。

本發(fā)明目的在于提供一種用于鑒定芽孢桿菌的基因擴(kuò)增通用引物。