[發明專利]用于鑒定芽孢桿菌的通用引物以及使用它們的分類方法

有效

• 申請號: 201110142323.0
• 申請日: 2011-05-30
• 公開（公告）號: CN102226216A
• 公開（公告）日: 2011-10-26
• 發明（設計）人: 馬平;李社增;郭慶港;鹿秀云;李寶慶
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 胡長遠

1.用于鑒定芽孢桿菌的基因擴增通用引物，其特征在于所述的通用引物由上游簡并引物和下游簡并引物組成，所述的上游簡并引物由SEQ?ID?No：1所示的核苷酸序列組成，所述的下游簡并引物由SEQ?ID?No：2所示的核苷酸序列組成。

2.利用權利要求1所述的通用引物對芽孢桿菌進行分類鑒定的方法，按照如下步驟進行：

(1)以待測菌株的基因組DNA為模板，以上游簡并引物和下游簡并引物為引物進行PCR擴增，對擴增所得的DNA片段進行回收、純化、測序，得phoPR基因序列；其中所述的上游簡并引物由SEQ?ID?No：1所示的核苷酸序列組成，所述的下游簡并引物由SEQ?ID?No：2所示的核苷酸序列組成；

(2)將步驟(1)測序所得待測菌株的phoPR基因的核苷酸序列與GeneBank數據庫中所有芽孢桿菌的phoP/phoR基因的核苷酸序列進行序列比對，序列比對結果中與待測菌株序列相似性最高的菌株所屬的種，即為該菌株所屬的種。

3.按照權利要求2所述的分類鑒定的方法，其特征在于其步驟(2)中所述的序列比對是將擴增所得的待測菌株的phoPR基因序列與GenBank數據庫中所有的芽孢桿菌的phoP/phoR基因序列通過BLAST進行序列比對；對比結果中與待測菌株序列相似性最高的芽孢桿菌菌株所屬的種，即為該菌株所屬的芽孢桿菌的種。

4.利用權利要求1所述的通用引物對芽孢桿菌進行分類鑒定的方法，按照如下步驟進行：

(1)以待測菌株的基因組DNA為模板，以上游簡并引物和下游簡并引物為引物進行PCR擴增，對擴增所得的DNA片段進行回收、純化、測序，得phoPR基因序列；其中所述的上游簡并引物由SEQ?ID?No：1所示的核苷酸序列組成，所述的下游簡并引物由SEQ?ID?No：2所示的核苷酸序列組成；

(2)利用Clustal?X軟件對2個以上的未知菌株的phoPR基因序列進行多重序列比對，比對過程中同時加入不同種的標準菌株的phoPR基因序列；然后利用MEGA軟件構建系統發育樹，在系統發育樹中與待測菌株親緣關系最近的標準菌株所對應的種，即為該菌株所屬的種。

5.按照權利要求2、3或4所述的分類鑒定的方法，其特征在于其步驟(1)中所述的PCR擴增的反應體系為：10×Buffer?5μl，dNTPs?8μl，phoPR-F1μl，phoPR-R?1μl，待測菌株基因組DNA?1μl，rTaq?DNA聚合酶1μl，ddH₂O33μl；共50μl。

6.按照權利要求5所述的分類鑒定的方法，其特征在于其步驟(1)中所述的PCR擴增的反應條件為：95℃?5min；94℃?45s，48℃?45s，72℃?1min，共35個循環；72℃?10min。

7.一種芽孢桿菌分類鑒定試劑盒，其特征在于含有由SEQ?ID?No：1和SEQID?No：2所示的核苷酸序列組成的基因擴增通用引物。

8.按照權利要求7所述的芽孢桿菌分類鑒定試劑盒，其特征在于還包括dNTPs、10×Buffer、rTaq?DNA聚合酶和超純水。