[發明專利]一種篩選PknB抑制劑的反應體系及其篩選方法

有效

• 申請號: 201110138454.1
• 申請日: 2011-05-25
• 公開（公告）號: CN102796807A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 余利巖;黃彬;趙莉莉;蘇靜;李秋萍;魏玉珍;張玉琴
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫藥生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/66
• 分類號: C12Q1/66;C12Q1/48;G01N21/64
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種PknB抑制劑的反應體系及其篩選方法。

背景技術

結核分枝桿菌(Mycobacteria?tuberculosis，Mtb)是人類肺結核(TB)的病原體。肺結核是一種嚴重威脅人類健康的傳染病，在全球范圍內每年造成多達三百萬人死亡。AIDS的蔓延和多重耐藥菌株的出現使肺結核的防控形勢異常嚴峻，傳統藥物已不能滿足需要。因此，必須加緊新型抗結核藥物的研發。藥物篩選模型的建立及潛在藥物的篩選處于藥物研發鏈條的最上游，為了開發出更加有效安全的新型抗結核藥物，首先必須建立高效的藥物篩選模型。

蛋白激酶PknB是其中的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以磷酸化包括其自身在內的多種底物蛋白。已有研究結果顯示，PknB參與多種重要生理進程的調控，為結核分枝桿菌生存所必需，具體包括：1.調控生長分裂，細胞形態以及細胞壁合成；2.調控熱應激等多種應激反應；3.調控谷氨酸代謝。有關PknB的生理功能仍在進一步的研究中，但其作為潛在藥物靶點的地位已得到廣泛認同。但采用哪些反應體系、以及如何更快、更有效地篩選PknB抑制劑，是亟待解決的技術問題。

發明內容

因此，本發明要解決的技術問題是開發一種用于篩選PknB抑制劑的反應體系，并建立一種基于蛋白激酶PknB的藥物篩選方法。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種用于篩選PknB抑制劑的反應體系，以及一種篩選PknB抑制劑的方法。

本發明的技術方案如下。

本發明用于篩選PknB抑制劑的反應體系含有如下濃度的反應物：

優選地，本發明的反應體系含有如下濃度的反應物：

本發明還提供一種篩選PknB抑制劑的方法，包括如下步驟：

步驟(1)配置如下反應體系：

步驟(2)設置如下各反應組：

i)樣品實驗組：取步驟(1)所述的反應體系，加入1μL濃度為1mg/mL～10mg/mL的樣品溶液；

ii)陰性實驗組：取步驟(1)所述的反應體系，加入1μL?DMSO；

iii)陽性對照組：取步驟(1)所述的反應體系，加入終濃度為60μg/ml的星形孢菌素；

步驟(3)制備熒光素酶反應液

采用Pomega公司的KinaseLuminescent?Kinase?Assay試劑盒進行活性測定，試劑盒中包括Kinase緩沖液和Kinase底物；將Kinase緩沖液在37℃下溶解，與Kinase底物充分混合，形成綠色澄清的溶液，即熒光素酶反應液；

步驟(4)篩選

將步驟(1)的各反應組在酶標儀中分別反應180min后，加入熒光素酶反應液，測定各反應組熒光值，計算反應抑制率，對反應具有抑制作用的即為陽性樣品。

優選地，所述反應體系為：

優選地，其中步驟(2)中樣品為化合物時，向50μL反應體系中加入1μL的1mg/mL的樣品溶液作為樣品實驗組。

優選地，其中步驟(4)為將步驟(2)中各反應組分別混勻后加入同一塊96孔板中，置于酶標儀內，開啟溫控為37℃進行反應，反應180min后取出，每孔均加入50μL熒光素酶反應液，置于酶標儀中測定每孔熒光值，每孔測定持續時間1s，測定次數1次；按以下公式計算各孔的抑制率：

其中：ΔF_N是陰性對照孔熒光值，ΔF_P是陽性對照孔熒光值，ΔF_S是樣品實驗孔熒光值。

優選地，抑制率大于30％的樣品為陽性樣品。

本發明的有益效果如下。

本發明選擇的蛋白激酶PknB作為藥物篩選的靶點具有其獨特的優點。PknB與其它蛋白激酶在結構以及催化特性方面的差異將有利于避免交叉耐藥的問題。另外，PknB在不同細菌中的序列比較保守，而且與真核生物的同種功能的蛋白之間不具有相關性，有利于篩選到對結核分枝桿菌有效的抗生素，而且所篩選到的化合物對人體的毒性也會很小。因此用PknB篩選抗結核的藥物的靶點，建立嶄新、低毒、高效的篩選模型。