[發明專利]一種檢測磷脂依賴性凝血因子X激活物酶活性的方法

無效

• 申請號: 201110136028.4
• 申請日: 2011-05-25
• 公開（公告）號: CN102798598A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 戴向榮;劉娟娟;方麗;楊中強;李小羿;張國輝
• 申請（專利權）人: 兆科藥業(合肥)有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;C12Q1/37
• 代理公司: 北京東正專利代理事務所(普通合伙) 11312
• 代理人: 劉瑜冬

技術領域

本發明涉及藥品、生物制品領域，具體涉及一種生色底物法測定磷脂依賴性凝血因子X激活物(FXA)酶活性的方法。

背景技術

蛇毒血凝酶是從蝰蛇毒中提取并利用現代生物技術分離純化精制而成。它是一種以止血作用為主的酶制劑，含有兩種可促進血液凝固的成分，分別為蝰蛇巴曲酶(Batroxobin)和磷脂依賴性凝血因子X激活物(簡稱FXA)。其中FXA是一種高度特異性的、具有蛋白水解酶特性的酶類，在響尾蛇和蝰蛇的蛇毒中分布廣泛。絕大多數蛇毒FXA是從圓斑蝰蛇和Macrovipera?lebetina中純化得到的，分別稱作為RVV-X和VLFXA，其中RVV-X的活力最強。這兩種FXA均由一條重鏈α及兩條由二硫鍵相連的C型凝集素結構的輕鏈β、γ組成，α重鏈和γ輕鏈的初級結構在兩者中相似，重鏈均含有金屬酶、去整合素和半胱氨酸富集結構域。

1994年Gowda等人用質譜測定得到RVV-X的分子量為92,880Da，SDS-PAGE顯示重鏈為57,600Da，輕鏈分別為19,400和16,400Da，等電點pI為4.2～7.8。其在中性條件下(pH＝6.5-8.0)穩定，在酸性(PH＝3～6)和堿性(PH＝9～11)條件下活性迅速下降。RVV-X的含糖量為10％，脫糖基化可顯著地影響其活力，催化速率下降約130倍。

早在1934年，Macfarlane和Barnett就發現FXA能夠加速血液凝固，并需要Ca²⁺參與才能夠達到最大活力，而且受金屬螯合劑的抑制。1962年，Williams和Esnouf用DEAE纖維素柱分離純化得到了促凝血物。FXA是一種能夠作用于凝血因子X和凝血因子IX的金屬酶，能夠切斷濃集于磷脂反應表面的凝血因子X重鏈上的Arg51-Ile52肽鍵，將其激活成為Xa。后者可參與外源性凝血和內源性凝血過程，與Ca²+、凝血因子Va及血小板磷脂(PF3)形成復合物(凝血酶原激活物)，將凝血酶原轉變為凝血酶，纖維蛋白原又被凝血酶酶解為纖維蛋白單體，其可促使凝血酶對因子ⅩⅢ的激活，在ⅩⅢ與鈣離子的參與下，相鄰的纖維蛋白發生快速共價交聯，形成不溶的穩定的纖維蛋白凝塊。因此，FXA最終可促使血管破損處的凝血酶形成，促進出血部位血小板聚集。

此外，凝血因子X的活化與腫瘤細胞的遷移有關。腫瘤細胞中含有一種蛋白可以直接把凝血因子X活化為Xa，這種行為會導致凝血纖維蛋白附著在腫瘤細胞表面上，使得腫瘤細胞在體內容易擴散。腫瘤細胞中的這類蛋白極難獲得，FXA可以模擬這種蛋白活化凝血因子X，這對腫瘤遷移機理有一定的意義。

目前，主要采用底物法測定FXA的活性，根據作用底物的不同可將測定方法分為兩大類：第一大類為天然底物法，即以人血漿為底物，通過判斷FXA的加入導致其發生凝固的時間來進行FXA活性測定，該法在20世紀80年代初得到普遍應用，方法常規，但需目測判斷纖維蛋白原凝固時間，受檢測者主觀干擾較大；另一大類為通過FXA水解生色底物產生有特征吸收的生色產物來進行活性測定。但目前多采用兩步法測定，即在FXA作用于凝血因子X一段時間后加入終止劑，同時加入生色底物，根據特定時間內Xa的生成量計算FXA的活性。此方法不能排除在活化的早期階段時間和Xa生成量之間可能存在非線性關系，因而不能精確地反映酶的活性作用特點。

鑒于上述方法的局限性，尋找一種高效、經濟的活性測定方法成為磷脂依賴性凝血因子X激活物應用研究的關鍵之一。

發明內容

本發明的目的在于提供一種簡單、可靠、準確地檢測磷脂依賴性凝血因子X激活物(FXA)酶活性的方法。

本發明中的FXA能夠將Human?Factor?X轉換成有水解酶活性的Xa因子(Factor?Xa)，Xa因子可切開其生色底物S-2765(Suc-Ile-Gly(γ-Pip)Gly-Arg-PNA)中的肽鍵，釋放出在405nm波長處有特定吸光值的黃色產物對硝基苯胺(PNA)，通過檢測405nm處PNA的吸光度，即可對FXA的酶活性進行測定，在這一波長下，其它物質對光的吸收小于PNA對光吸收的1％。隨著酶活性梯度變化，吸光度也呈現梯度變化，在一定時間內，反應產物吸光度與酶活線性相關。據此可繪制FXA標準曲線并計算待測樣品的酶活性。該方法包括以下步驟：

(1)配制pH＝7.4，濃度為0.02M的Tris-HCl緩沖液；

(2)配制濃度為0.075M的CaCl₂溶液；