[發明專利]一種檢測磷脂依賴性凝血因子X激活物酶活性的方法

無效

• 申請號: 201110136028.4
• 申請日: 2011-05-25
• 公開（公告）號: CN102798598A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 戴向榮;劉娟娟;方麗;楊中強;李小羿;張國輝
• 申請（專利權）人: 兆科藥業(合肥)有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;C12Q1/37
• 代理公司: 北京東正專利代理事務所(普通合伙) 11312
• 代理人: 劉瑜冬

1.一種檢測磷脂依賴性凝血因子X激活物(FXA)酶活性的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)配制pH＝7.4，濃度為0.02M的Tris-HCl緩沖液；

(2)配制濃度為0.075M的CaCl₂溶液；

(3)用10ml(1)步制備的緩沖液將10mg人血清白蛋白配制成濃度為1mg/ml血清白蛋白稀釋液；

(4)FXA生色底物S-2765與(1)步制備的緩沖液和(2)步制備的CaCl₂溶液混合，配制成溶液A；

(5)用(1)步制備的緩沖液將Human?Factor?X稀釋成溶液B；

(6)用(1)步制備的緩沖液和(3)步制備的血清白蛋白稀釋液將已知濃度的FXA單體標準品稀釋成一系列不同濃度的母液C_n(n≥1)；

(7)用(1)步制備的緩沖液和(3)步制備的血清白蛋白稀釋液將待測樣品稀釋成溶液D_n(n≥1)；

(8)將相同體積的一系列不同濃度標準品母液C₁、C₂、C₃......C_n(n≥1)與待測樣品溶液D_n分別加到酶標板不同孔中，再向每孔中補充相同體積的溶液A和相同體積的溶液B，保持每孔溶液的總體積一致，把孔內溶液混勻，立即放入預熱至37℃的酶標儀中反應，分別測定每孔中酶解產物對硝基苯胺(PNA)的吸光度A405，并根據測定得到的不同濃度標準品母液吸光度A405值，繪制FXA單體標準品的濃度-吸光度線性標準曲線；

(9)將測定得到的待測樣品D_n的吸光度A405值，代入(8)步得到的PNA標準曲線，確定待測樣品的酶濃度和活性。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，(5)步中溶液B的濃度為2.5μM。

3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，(4)步中溶液A的制備過程為用(1)步制備的緩沖液將FXA生色底物S-2765配制成3mM的濃度后，精密量取0.8ml已制備3mM?S-2765溶液并加入0.6ml(2)步制備的CaCl₂溶液，混勻。

4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，(6)步中母液C的濃度分別為1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2Ku/ml。

5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，(8)步中酶標板每孔加入標準品母液C和待測樣品溶液D體積均為7μl，溶液A體積為23μl、溶液B體積為30μl，每孔溶液總體積為60μl。

6.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述酶標板中每孔溶液總反應體積為60μl時，加入FXA單體標準品母液C活性單位＜2Ku/孔，溶液A濃度≥0.039mM。

7.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述(8)步中酶標儀預熱時間為4分鐘，反應時間為15分鐘。