[發明專利]一種溶栓蛋白酶基因NKS1及用途

無效

• 申請號: 201110135907.5
• 申請日: 2011-05-25
• 公開（公告）號: CN102337282A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 王沁;夏濤
• 申請（專利權）人: 王沁;夏濤
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N15/63;C12N15/10;C12Q1/68;G06F19/22;A61K38/48;A61K48/00;A61P7/02
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 何新平

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技術領域

本發明涉及基因工程領域、分子生物學領域。具體地，本發明涉及一種利用DNA改組技術獲得功能顯著提高的溶栓蛋白酶基因，以及利用此基因生產溶栓藥物。

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背景技術

隨著生活水平的提高和壽命的延長，血栓病的發生率和病死率日趨增高，已成為人類疾病的頭號殺手。溶解血栓是治療這一類疾病的重要手段，因此尋找理想的溶栓藥物已成為國內外研究非常活躍的一個領域，并具有巨大的科學價值、經濟價值和社會效益。

納豆是一種久經千年考驗的百姓認可的古老的保健食品。近年研究發現，納豆中存在纖維蛋白溶解酶，具有獨特的纖溶功能,?藥效迅速、效力強、促進和激發機體內其它因子纖溶效能、半衰期長、無任何毒性和副反應等，是目前眾多纖溶藥物所難以媲美的,它是新型溶栓藥物篩選的難得的候選者。

1988年,日本學者在日本生產的納豆中提取得到了血栓溶解酶,并定名為納豆纖維蛋白溶解酶,簡稱納豆酶(Natto?Kinase,NK)。納豆激酶是納豆在發酵過程中由納豆芽孢桿菌(Bacil1us?natto)?產生的具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶。隨后的研究對納豆酶的分子結構、理化性質等有了進一步的了解。納豆酶是納豆菌經由大豆絲制造出來的酶制品，白色粉末狀,無異臭。分子量為27728?Dalton,?在pH?7～12條件下比較穩定，低于5.0時則極不穩定。當溫度高達60℃時,則因蛋白變性而迅速失活。反復凍融不影響其活性。納豆激酶由275個氨基酸組成,含有8個賴氨酸殘基。酶的活性部位在Asp32、His64和Ser221,與底物結合部位在Ser125,Len126,Gly127處。研究發現納豆酶的最敏感的底物為血漿纖溶酶。納豆激酶有其特異的水解蛋白的氨基酸作用和識別位點。同時,納豆酶在血流中的半衰期長達8天,比尿激酶、鏈激酶以及但織型纖溶解原激活劑都長。研究表明,納豆激酶能顯著溶解體內外血栓,明顯縮短優球蛋白的溶解時間(?ELT)?,并能刺激靜脈內皮細胞產生纖溶酶原激活劑,從而更有效地發揮溶栓效果。研究結果還表明,?NK除具有較強的溶栓作用外,還具有以下幾個優點:?(1)?來源于食品,安全性能好;(2)?分子量小,是一個單鏈蛋白質,體內半衰期長,可能更易被人體消化吸收;?(3)?可由消化道吸收,因此有成為口服性藥物的可能;?(4)?NK對纖維蛋白的作用機制不同于UK等現用于臨床的藥物,它同纖溶酶一樣直接作用于纖維蛋白,同時可以激活體內的tPA;?(5)?可以用細菌進行液體發酵生產,造價低廉.?可以預見,?NK可能成為新一代治療血栓的口服藥物。

為了獲得大量的納豆激酶,國際上多采用改良菌種和改善納豆生產工藝等方法,國內主要采用改善納豆桿菌液體發酵條件、改善納豆激酶的純化方法等?。Nakamura?等人于1992?年公布了納豆激酶基因序列,使得利用基因工程方法生產納豆激酶成為可能。目前已成功地從分泌納豆激酶的枯草桿菌基因組中擴增得到了納豆激酶的編碼基因,?構建了納豆激酶基因的表達載體,?并在大腸桿菌?、枯草芽孢桿菌?、畢赤酵母??、昆蟲桿狀病毒中實現了表達。

綜上所述,?納豆激酶具有十分良好的應用開發價值。目前存在的主要問題是，利用基因工程的方法生產納豆激酶普遍存在酶活不高的現象。因此，如何利用分子生物學技術提高納豆激酶的酶活，成為利用該基因生產納豆激酶的關鍵。

DNA改組(DNA?Shuffling)技術是目前蛋白質、酶和單克隆抗體等體外定向進化的快速高效方法,在提高酶活性、蛋白質產量和改善蛋白質(酶)的性能等方面具有廣泛的應用前景。其原理是將一組緊密相關的核酸序列隨機片段化，然后利用無引物PCR將這些隨機片段進行重新組裝而得到全長的核酸序列，在這個過程中引入突變并對不同的突變進行廣泛的重組，從而完成對目的核酸序列的迅速進化，以提高核酸序列或其編碼的蛋白的功能(Stemmer?W?P.?DNA??shuffling?by?random?fragmentation?and?reassembly:?in?vitro?recombination?for??molecular?evolution.?Proc?Natl?Acad?Sci?USA.?1994,?91:10747～10751)。