[發明專利]一種鑒定細胞吞噬外源異物的功能及細胞吞噬外源異物能力的方法

無效

• 申請號: 201110130358.2
• 申請日: 2011-05-19
• 公開（公告）號: CN102251017A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 劉利平;樂亞玲;陳桃英
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 上海天翔知識產權代理有限公司 31224
• 代理人: 呂伴

技術領域

本發明涉及一種鑒定細胞是否具有吞噬外源異物的功能及研究細胞吞噬外源異物能力的方法。

背景技術

吞噬作用(phagocytosis)是指細胞把入侵的病原體(如細菌和病毒)轉運到細胞內并加以清除的過程，此過程構成生物體先天免疫的第一道防線。

吞噬作用是所有后生動物的一種原始的防御機制。早在1862年，Haeckel就描述了腹足動物血細胞的吞噬作用過程，但是，吞噬作用在免疫防御上的重要性直到1882年才被Metchnikoff意識到(Vaughan，1965)。吞噬作用在動物界中普遍存在，低等單細胞動物通過吞噬作用取食，高等多細胞動物則通過吞噬細胞來清除外來物質，吞噬過程可以概括為：識別，粘連，聚集，攝入，清除等(王金星等，2004)。等(1986)發現透明細胞具有較強的吞噬能力。由于吞噬能力在一定程度上反映了機體免疫力的變化，而吞噬能力一般用吞噬百分比和吞噬指數來表示。

在研究吞噬作用中，不同學者采用不同的感染源。目前有文獻報道了臘蛾(Galleria?mellonella)、貽貝、Procambarus?zonangulus等吞噬細胞對用FITC標記的硅膠顆粒、酵母和酵母聚糖A(zymosan?A)的吞噬作用；而國內研究主要是利用金黃色葡萄球菌作為外源感染源，甲醇固定、Gimesa染色后用顯微鏡觀察。由于酵母細胞透明，在顯微鏡下不易辨認；FITC熒光素不穩定，易受溫度、pH值、雜質、細胞固定劑及溶劑等多種因素的影響；而金黃色葡萄球菌是一種常見的致病菌，能引起人和動物的多種疾病，而且作為感染源時，需甲醇固定，Gimesa染色，過程繁瑣且不易觀察吞噬過程。因此選擇一種效果明顯、易觀察的感染源非常必要。

(Tojo?et?al.，2000；Cima?et?al.，2001；Barracco?t?al.，1999；Cárdenas?et?al.，2000；南旭陽，2009；林清華，1999；魏克強，2006；陳孝煊等，2002；)增強型綠色熒光蛋白因能穩定表達，在生物學研究中常被用作指示物，而將pEGFP轉化到大腸桿菌的技術相當成熟。表達了綠色熒光蛋白的大腸桿菌具有外源微生物的特性，綠色熒光蛋白還能在大腸桿菌內穩定、持續表達，熒光不易淬滅，樣品還可以長時間保存。而吞噬了大腸桿菌的血細胞在熒光顯微鏡下清楚可見，能迅速準確得到吞噬百分比及吞噬指數，且吞噬大腸桿菌后還可以利用流式細胞儀對有吞噬作用的血細胞進行分選。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于針對現有研究吞噬作用中所采用的感染源存在的問題而提供一種鑒定細胞是否具有吞噬外源異物的功能及研究細胞吞噬外源異物能力的方法。

本發明所要解決的技術問題可以通過以下技術方案來實現：

一種鑒定細胞吞噬外源異物的功能及研究細胞吞噬外源異物能力的方法，包括感染源制備步驟、混合培養步驟、在熒光顯微鏡直接觀察研究細胞對所述感染源吞噬、包囊的整個吞噬過程步驟、分析不同條件下所述研究細胞吞噬能力的變化得出吞噬指標步驟，其特征在于所述感染源制備步驟是制備表達綠色熒光蛋白的大腸桿菌。

所述混合培養步驟是指將所述感染源制備步驟制備的表達綠色熒光蛋白的大腸桿菌與所述研究細胞按照細胞個數10∶1的比例混合，培養1小時制成觀察液。

所述在熒光顯微鏡直接觀察研究細胞對所述感染源吞噬、包囊的整個吞噬過程步驟是指將所述混合培養步驟培養的觀察液制成血涂片于熒光倒置顯微鏡下觀察。

所述分析不同條件下所述研究細胞吞噬能力的變化得出吞噬指標步驟是指在顯微鏡下清晰觀察每個視野中參與吞噬的細胞，吞噬細胞中的大腸桿菌數及視野中的總細胞，并且能辨別參與吞噬細胞的類型；然后將每個視野中的參與吞噬的細胞、吞噬細胞中的大腸桿菌數及視野中的總細胞的指標累計，以下列公式分別計算所述研究細胞的吞噬百分比及吞噬指數：

由于采用了如上的技術方案，本發明將能表達綠色熒光蛋白的大腸桿菌作為感染源，研究各類細胞的吞噬作用。具有直觀、準確、快速、方便等優點。本發明還可以觀察具有吞噬功能的細胞類型。

附圖說明

圖1本發明實施例1中克氏原螯蝦血細胞對能表達綠色熒光蛋白的大腸桿菌的吞噬作用熒光顯微鏡下觀察的示意圖。

其中：

圖1A為熒光顯微鏡下觀察的能表達綠色熒光蛋白的大腸桿菌示意圖；

圖1B為熒光顯微鏡下觀察的克氏原螯蝦血淋巴細胞(明場+熒光)示意圖；