[發明專利]香蒲假莖總蛋白質的提取和雙向電泳分析方法

有效

• 申請號: 201110128948.1
• 申請日: 2011-05-18
• 公開（公告）號: CN102241730A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 楊立明;羅玉明;張瑞越;張瑞越;陳楨雨
• 申請（專利權）人: 淮陰師范學院
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;G01N1/34;G01N27/447;G01N27/62
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 楊海軍

技術領域

本發明涉及一種植物的質量分析和鑒定方法，具體涉及一種香蒲假莖中的總蛋白質的提取和雙向電泳分析方法，屬于生物技術領域。

背景技術????????

香蒲(Typha?latifolia?L.)，又名蒲菜、蒲草、水蠟燭，為香蒲科香蒲屬多年生宿根性沼澤草本植物，分布于世界各地的沼澤及淡水湖泊中。在我國部分地區，其營養體幼嫩部分被用來作為蔬菜食用，風味獨特，營養豐富，并且蒲菜還具有藥用價值，其性味甘平，微涼，具有清涼補血，利水消腫之功效，因而是一種營養豐富并具一定藥療功能的保健型蔬菜。蒲菜中的主要營養物質和和藥效物質為蛋白質類化合物，但植株體內還含有較多的次生代謝產物（如：色素、酚類、醌類等物質），現有技術中還沒有針對蒲菜中蛋白成分的質量分析方法。因此為了對香蒲這一藥食兩用植物進行深入研究，并能方便鑒別其真偽，并對香蒲進行質量控制，為實現科學化種植和培育提供質控標準，很有必要在現有技術的基礎上研究設計一種能對香蒲中的總蛋白質進行分離，建立適用于香蒲蛋白質組分有效分離、分析的方法，該方法可為香蒲水生植物材料蛋白質組學研究提供實驗基礎和參考。

發明內容

發明目的：本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種香蒲假莖總蛋白質的提取和雙向電泳分析方法。

技術方案：為了實現以上目的，本發明提供的香蒲假莖總蛋白質的提取和雙向電泳分析方法，具體包括以下步驟：

(1)采集香蒲假莖，用超純水洗凈，并用濾紙吸去多余水分，放入液氮中速凍，并移至-80℃冰箱保存備用；

(2)稱取5g步驟(1)保藏的香蒲假莖迅速放入冰浴的研缽中，加液氮研磨成細粉，研磨過程中加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮，把研磨后的細粉轉入-20℃預冷的50ml離心管中，加入3倍體積-20℃預冷的三氯乙酸（TCA）/丙酮溶液，充分混合后，放在-20℃冰箱中靜置2小時，備用；

(3)取步驟(2)得到的香蒲假莖細粉的三氯乙酸（TCA）/丙酮溶液，在35000?轉/分鐘，4℃離心30min，移去上清液，取沉淀，加入25ml預冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20℃保存1小時，期間間隔渦旋；然后在35000?轉/分鐘，4℃離心?30min，移去上清液，取沉淀，再加入25?ml?-20℃預冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20℃保存1小時，期間間隔渦旋；然后在35000轉/分鐘，4℃離心?30min，去掉上清液后，用濾紙將離心管封口，真空冷凍干燥，得到香蒲假莖蛋白粉；備用；

(4)取步驟(3)得到的香蒲假莖蛋白粉在4℃溶于樣品裂解液中1?小時，期間在裂解液中加玻璃珠，并用超聲波超聲三次，每次3分鐘；然后在35000轉/分鐘，4℃離心?30min，得到上清液；然后用3倍體積預冷的樣品洗滌液在-20℃沉淀1小時，然后再在35000轉/分鐘，4℃、離心30min，棄上清液，得離心沉淀后溶解于樣品裂解液，在4℃溶解1小時，然后在35000轉/分鐘，4℃離心?30min，取上清液，得到香蒲假莖蛋白質提取液，備用；

(5)取步驟(4)得到的香蒲假莖蛋白質提取液，采用考馬斯亮蘭法（Bradford）測定其蛋白濃度，對蛋白質進行定量；

(6)取步驟(4)得到的香蒲假莖蛋白質提取液進行電泳分析或對蛋白質進行質譜檢測和分析。:

第一向等電聚焦電泳：按上樣量500μg，上樣體積450μl,?用水化液對已定量好的香蒲假莖蛋白樣品進行稀釋；將香蒲假莖蛋白樣品加入水化盤內后，再將線性IPG膠條（優選pH?4-7，24cm，GE?Healthcare，Piscataway，NJ，USA）膠面向下放入水化盤中，除去膠面與蛋白樣品液間的氣泡，每個膠條用7ml礦物油覆蓋膠條，進行水化；水化結束后進行等電聚焦；

(7)膠條平衡處理：將步驟(6)等電聚焦完成后的IPG膠條進行平衡2次，每次平衡時間為15min，二次平衡緩沖液配制如下：

膠條平衡緩沖液母液：6mol/L的尿素，質量體積比2%的十二烷基磺酸鈉（SDS），0.375mol/L的Tris-HCl（優選pH為8.8），體積比30%甘油，溶劑為水；

第一次膠條平衡緩沖液????????????????????????????????????????????????為：每1ml膠條平衡緩沖液母液加入20mg?二硫蘇糖醇(DTT)；

第二次膠條平衡緩沖液為：每1ml膠條平衡緩沖液母液加入25mg碘乙酰胺；