[發(fā)明專利]香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110128948.1
• 申請(qǐng)日: 2011-05-18
• 公開（公告）號(hào): CN102241730A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊立明;羅玉明;張瑞越;張瑞越;陳楨雨
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 淮陰師范學(xué)院
• 主分類號(hào): C07K1/14
• 分類號(hào): C07K1/14;G01N1/34;G01N27/447;G01N27/62
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 楊海軍

1.香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)采集香蒲假莖，用超純水洗凈，并用濾紙吸去多余水分，放入液氮中速凍，并移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)稱取5g步驟(1)保藏的香蒲假莖迅速放入冰浴的研缽中，加液氮研磨成細(xì)粉，研磨過程中加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮，把研磨后的細(xì)粉轉(zhuǎn)入-20℃預(yù)冷的50ml離心管中，加入3倍體積-20℃預(yù)冷的三氯乙酸/丙酮溶液，充分混合后，放在-20℃冰箱中靜置2小時(shí)，備用；

(3)取步驟(2)得到的香蒲假莖細(xì)粉的三氯乙酸/丙酮溶液，在35000?轉(zhuǎn)/分鐘，4℃離心30min，移去上清液，取沉淀，加入25ml預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20℃保存1小時(shí)，期間間隔渦旋；然后在35000?轉(zhuǎn)/分鐘，4℃離心?30min，移去上清液，取沉淀，再加入25?ml?-20℃預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20℃保存1小時(shí)，期間間隔渦旋；然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃離心?30min，去掉上清液后，用濾紙將離心管封口，真空冷凍干燥，得到香蒲假莖蛋白粉；備用；?

(4)取步驟(3)得到的香蒲假莖蛋白粉在4℃溶于樣品裂解液中1?小時(shí)，期間在裂解液中加玻璃珠，并用超聲波超聲三次，每次3分鐘；然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃離心?30min，得到上清液；然后用3倍體積預(yù)冷的樣品洗滌液在-20℃沉淀1小時(shí)，然后再在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃、離心30min，棄上清液，得離心沉淀后溶解于樣品裂解液，在4℃溶解1小時(shí)，然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃離心?30min，取上清液，得到香蒲假莖蛋白質(zhì)提取液，備用；

(5)取步驟(4)得到的香蒲假莖蛋白質(zhì)提取液，采用考馬斯亮蘭法測(cè)定其蛋白濃度，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量；

(6)取步驟(4)得到的香蒲假莖蛋白質(zhì)提取液進(jìn)行電泳分析:

第一向等電聚焦電泳：按上樣量500μg，上樣體積450μl,?用水化液對(duì)已定量好的香蒲假莖蛋白樣品進(jìn)行稀釋；將香蒲假莖蛋白樣品加入水化盤內(nèi)后，再將線性IPG膠條膠面向下放入水化盤中，除去膠面與蛋白樣品液間的氣泡，每個(gè)膠條用7ml礦物油覆蓋膠條，進(jìn)行水化；水化結(jié)束后進(jìn)行等電聚焦；

(7)膠條平衡處理：將步驟(6)等電聚焦完成后的IPG膠條進(jìn)行平衡2次，每次平衡時(shí)間為15min，二次平衡緩沖液的配制分別如下：

膠條平衡緩沖液母液組成：6mol/L的尿素，質(zhì)量體積比2%的十二烷基磺酸鈉，0.375mol/L的Tris-HCl，體積比30%甘油，溶劑為水；

第一次膠條平衡緩沖液????????????????????????????????????????????????為：每1ml膠條平衡緩沖液母液加入20mg?二硫蘇糖醇；

第二次膠條平衡緩沖液為：每1ml膠條平衡緩沖液母液加入25mg碘乙酰胺；

第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳：將平衡后的膠條置于膠濃度為12.5%的SDS-PAGE凝膠上，用濃度為0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖的封膠液封住頂部，其中瓊脂糖中含有質(zhì)量體積比為0.002%的溴酚藍(lán)，然后按如下參數(shù)進(jìn)行電泳：16℃恒溫，恒功率條件下，用2瓦/根膠條電泳1.5h，再用12瓦/根膠條電泳4~6h，直到溴酚藍(lán)移動(dòng)到需要的位置為止；

(8)電泳結(jié)束后對(duì)蛋白采用硝酸銀法進(jìn)行染色分析或?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)和分析。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，其特征在于，步驟(2)所述的三氯乙酸/丙酮溶液由下列物質(zhì)組成：質(zhì)量體積比10%的三氯乙酸，質(zhì)量體積比0.07%的二硫蘇糖醇，1mmol/L的苯甲基磺酰氟，其余溶劑為丙酮。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，其特征在于，步驟(3)所述的樣品洗滌液由下列物質(zhì)組成：質(zhì)量體積比0.07%?的二硫蘇糖醇和1mmol/L的苯甲基磺酰氟，其余溶劑為丙酮。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，其特征在于，步驟(4)樣品裂解液由下列物質(zhì)組成：7mol/L的尿素、2mol/的硫脲、質(zhì)量體積比4%的3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、65mmol/L的二硫蘇糖醇、1mmol/L苯甲基磺酰氟、體積比0.2%的載體兩性電解質(zhì)，溶劑為水。