[發明專利]用于檢測豬瘟病毒野毒株的引物對、探針、以及試劑盒

有效

• 申請號: 201110124916.4
• 申請日: 2011-05-16
• 公開（公告）號: CN102212617A
• 公開（公告）日: 2011-10-12
• 發明（設計）人: 孫明;陳西釗;陳南華;喬明明;陳曦;田克恭
• 申請（專利權）人: 北京世紀元亨動物防疫技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 程泳

技術領域

本發明屬于病毒檢測領域，涉及一種用于檢測豬瘟病毒野毒株的引物對、探針、以及試劑盒。本發明還涉及一種檢測豬瘟病毒野毒株的方法以及所述的引物對、探針、或試劑盒在檢測豬瘟病毒野毒株中的用途。

背景技術

豬瘟(Classical?Swine?Fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical?Swine?Fever?Virus，CSFV)引起的豬的高度致死性、接觸性傳染病，在世界上許多國家和地區均有發生，國際獸疫局將其定為A類傳染病，我國《動物防疫法》將其列為一類傳染病，給各國養豬業造成巨大的經濟損失。我國政府一直都很重視豬瘟的防制工作，并對豬進行豬瘟兔化弱毒疫苗免疫，但隨著豬瘟HCLV疫苗的廣泛使用，又由于近年來我國豬瘟的流行特點以散發、慢性豬瘟、持續感染和亞臨床癥狀為主，同時存在著與其它病混合感染的狀況，因此對其診斷非常困難。目前尚沒有簡單快速試劑盒能夠檢測豬瘟病毒野毒株(除豬瘟疫苗株之外的豬瘟病毒株)感染。

實時熒光定量PCR(FQ-PCR，又稱為實時熒光RT-PCR)技術包括探針法、染料法和引物法。探針法是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加，以Taqman探針為代表，常用的熒光報告基團是FAM、VIC、JOE、HEX等；染料法是采用一種能夠與雙鏈DNA小溝結合的熒光染料，熒光信號強弱與雙鏈DNA的數量相關，可以根據熒光信號換算出PCR反應中的雙鏈DNA數量，常用的染料是SYBR?green；引物法是利用熒光標記的引物實現定量，目標特異的引物對中的一個引?物3’端用熒光報告基團標記，在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發夾結構，使熒光淬滅，在模板存在的情況下，引物與模板配對，發夾結構打開，產生特異的熒光信號。

在熒光定量檢測中較常用的是Taqman探針法，根據其3’端標記的熒光淬滅基團的不同又可分為常規Taqman探針和Taqman-MGB探針兩種。常規的Taqman探針5’端標以熒光發射基團，3’端標以熒光淬滅基團，該探針在PCR過程中不能被延伸。當探針保持完整時，3’端淬滅基團抑制5’發射基團的熒光發射。在PCR的退火期，探針與引物所含序列內的DNA模板發生特異性雜交。延伸期引物在Taq酶作用下延伸，當到探針處，Taq酶發揮5’-3’外切核酸酶活性，繼而發生置換。切斷探針后，發光基團遠離淬滅基團，熒光信號得到釋放。這時熒光探測系統便會檢測到光密度有所增加。模板每復制一次，就有一個探針被切斷，并伴有一個熒光信號的釋放。由于理論上被釋放的熒光基團數目和PCR產物數量是一對一的關系，且光密度同釋放的熒光基團數目和PCR產物數量是一對一的關系，且光密度同釋放的熒光基團的數目也成正比關系，因此該技術可對模板進行準確定量。由于擴增產物較短時效率較高，故擴增長度一般為50-150bp。

Taqman-MGB探針與普通Taqman水解探針不同之處在于Taqman-MGB探針的3’端連接一個不發光的淬滅基團，同時另增加一個小溝結合物(minor?groove?binder，MGB)分子，比Taqman探針有三大優勢：一是顯著提高Tm值，可以減少探針設計長度，對AT富含區的探針設計更為有利；二是可以降低背景熒光信號，提高信噪比，使實驗結果更精確，分辨率更高；三是提高探針和互補模板的結合特異性，即使一個堿基的不匹配都能精確分辨。

目前檢測豬瘟病毒的病原學診斷技術有病毒分離法、免疫熒光技術、兔體交互免疫試驗、ELISA抗原捕獲、RT-PCR技術和實驗動物法等。以上幾種方法及其不太成熟的試劑盒通常存在靈敏度低、特異性差、耗時、無法區分免疫群與感染群等諸多問題，不能為我國快速、有效地監控豬瘟疫情提供強有力的技術支持。

公開號為CN101328506A和CN101812539A的專利申請公開了檢測豬瘟病毒的試劑盒。但是檢測的敏感性有待于進一步提高。此外，CN101328506A中公開的試劑盒生產成本高并且操作繁瑣。

因此，亟需一種敏感性高、特異性強、并且快速簡便的檢測“豬瘟病毒野毒株”的產品和方法。

發明內容

本發明人經過創造性的勞動和大量的試驗，得到了能夠用于檢測豬瘟病毒野毒株的引物對和探針，并且驚奇地發現，所述引物對和探針檢測豬瘟病毒野毒株的特異性強、靈敏度高。由此提供了下述發明：