[發明專利]體內終端氨基酸標記的定量蛋白質組學方法

有效

• 申請號: 201110123885.0
• 申請日: 2011-05-13
• 公開（公告）號: CN102243218A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 聶愛英;張磊;晏國全;姚鋆;張揚;賀福初;楊芃原;陸豪杰
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術領域

本發明屬于蛋白質組學技術領域，具體涉及一種體內終端氨基酸標記的定量蛋白質組學方法。

背景技術

蛋白質組學研究已成為21世紀生命科學的焦點之一，隨著研究方法和技術的深入開展，僅能提供蛋白質種類和修飾信息的定性蛋白質組學已經不能滿足目前研究工作的需要，有關蛋白質相對量變化的定量蛋白質組學已經迅速成為蛋白質組學研究的一個熱點和快速發展的領域。目前，蛋白質組學領域內的定量方法，可以分為，同位素標記和無同位素標記定量；體內標記和體外標記定量；相對定量和絕對定量等多種方法。根據肽段被如何標記和定量，我們將定量蛋白質組學分為：一級質譜質量差異定量和串級質譜同重同位素標簽定量兩個分類。細胞培養穩定同位素標記（SILAC），O¹⁸-酶解標記定量和化學衍生化定量都屬于一級質譜質量差異定量，同重同位素標簽蛋白質相對和絕對定量（iTRAQ）和串級質量標記（TMT）都屬于串級質譜同重同位素標簽定量?；谝患壻|譜的定量方法隨著選用重同位素氨基酸種類的增加也使一級質譜圖復雜度隨之增加，而且其中的O¹⁸-酶解標記方法和化學衍生化方法由于涉及到化學標記效率和化學副反應問題，降低了標記的效率和鑒定的準確度，增加了定性和定量的難度。相比前者，同重同位素標簽的串級質譜定量克服了一級質譜定量中一級譜圖復雜度增加的問題，而且由于一級母離子同重只在一級質譜中出現一個峰，大大提高了一級質譜信號的靈敏度，但是由于串級標簽離子處于低分子量端，受到低端背景離子的干擾，質譜信號受到很大的抑制，降低了定量的準確度和可靠度。

發明內容

本發明的目的在于提供一種準確、可靠、操作簡單、高效并適應于蛋白質組學研究要求的體內終端氨基酸標記的定量蛋白質組學方法。

本發明提出的體內終端氨基酸標記的定量蛋白質組學方法，其包括以下步驟：

A、培養基的配制：

（a）、在缺乏精氨酸和賴氨酸的DMEM細胞培養基中加入重同位素標記的精氨酸、正常的賴氨酸、透析牛胎血清、青霉素、鏈霉素和脯氨酸；

（b）、在另一缺乏精氨酸和賴氨酸的DMEM細胞培養基中加入重同位素標記的賴氨酸、正常的精氨酸、透析牛胎血清、青霉素、鏈霉素和脯氨酸；

其中，重同位素標記的精氨酸與正常的精氨酸相比，分子質量有所增加，重同位素標記的賴氨酸與正常的賴氨酸相比，分子質量也有所增加，并且二者增加的分子質量相等，重同位素標記的賴氨酸稱為重賴氨酸，重同位素標記的精氨酸稱為重精氨酸；

B、細胞培養：分別使用上述兩種培養基，培養細胞；

C、全蛋白提取：收集傳代6代以上的細胞，分別從重賴氨酸標記的細胞和重精氨酸標記的細胞中提取全蛋白；

D、不同比例全蛋白提取物的混合：分別將從重賴氨酸標記的細胞中提取出的全蛋白和重精氨酸標記的細胞中提取出的全蛋白按照不同質量比進行混合，前后兩種全蛋白的質量比范圍為1:10-10:1；

E、蛋白混合物前處理：在碳酸氫銨水溶液中，溶解不同質量比的蛋白混合物，依次加入二硫蘇糖醇和碘乙酰胺進行還原烷基化，然后加入特異性內切酶Lys-N和Arg-C，進行酶解，反應結束后凍干，將凍干粉重新溶解于體積比為20-25%乙腈、75-80%?10-20mM的磷酸二氫鉀溶液中，留待分析；

F、蛋白混合物的檢測：將上述得到的凍干粉重新溶解的溶液注入強陽離子交換液相色譜進行分離，按峰形收集組分，將每個組分分別凍干后再重新溶解于體積比為0.05-0.1%甲酸的純水溶液中，將所得到的各組分重溶液通過反相液相色譜與質譜LTQ-Orbitrap聯用進行檢測，提取串級質譜中具有固定質量增加的b,?y碎片離子對的峰強度，做比值后確定相應肽段和蛋白的相對量。

本發明方法中，步驟A中所述重/正常精氨酸、重/正常賴氨酸和脯氨酸的終濃度分別為80-90、140-150和195-205?μg/ml。

本發明方法中，步驟D中所述從重賴氨酸標記的細胞中提取出的全蛋白和從重精氨酸標記的細胞中提取出的全蛋白混合時按照的不同質量比可選取為1:10、1:5、1:1和5:1。