[發明專利]體內終端氨基酸標記的定量蛋白質組學方法

有效

• 申請號: 201110123885.0
• 申請日: 2011-05-13
• 公開（公告）號: CN102243218A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 聶愛英;張磊;晏國全;姚鋆;張揚;賀福初;楊芃原;陸豪杰
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

1.一種體內終端氨基酸標記的定量蛋白質組學方法，其特征在于具體步驟：

A、培養基的配制：

（a）、在缺乏精氨酸和賴氨酸的DMEM細胞培養基中加入重同位素標記的精氨酸、正常的賴氨酸、透析牛胎血清、青霉素、鏈霉素和脯氨酸；

（b）、在另一缺乏精氨酸和賴氨酸的?DMEM?細胞培養基中加入重同位素標記的賴氨酸、正常的精氨酸、透析牛胎血清、青霉素、鏈霉素和脯氨酸；

其中，重同位素標記的精氨酸與正常的精氨酸相比，分子質量有所增加，重同位素標記的賴氨酸與正常的賴氨酸相比，分子質量也有所增加，并且二者增加的分子質量相等，重同位素標記的賴氨酸稱為重賴氨酸，重同位素標記的精氨酸稱為重精氨酸；

B、細胞培養：分別使用上述兩種培養基，培養細胞；

C、全蛋白提取：收集傳代6代以上的細胞，分別從重賴氨酸標記的細胞和重精氨酸標記的細胞中提取全蛋白；

D、不同比例全蛋白提取物的混合：分別將從重賴氨酸標記的細胞中提取出的全蛋白和從重精氨酸標記的細胞中提取出的全蛋白按照不同質量比進行混合，所述質量比的范圍為1:10-10:1；

E、蛋白混合物前處理：在碳酸氫銨水溶液中，溶解不同質量比的蛋白混合物，依次加入二硫蘇糖醇和碘乙酰胺進行還原烷基化，然后加入特異性內切酶Lys-N和Arg-C進行酶解，反應結束后凍干，將凍干粉重新溶解于體積比為20-25%乙腈、75-80%?10-20mM磷酸二氫鉀溶液，留待分析；

F、蛋白混合物的檢測：將上述得到的凍干粉重溶液注入強陽離子交換液相色譜進行分離，按峰形收集組分，將每個組分分別凍干后再重新溶解于體積比為0.05-0.1%甲酸的純水溶液中，將所得到的各組分重溶液通過反相液相色譜與質譜LTQ-Orbitrap聯用進行檢測，提取串級質譜中具有固定質量增加的b,?y碎片離子對的峰強度，做比值后確定相應肽段和蛋白的相對量。

2.根據權利要求1所述的體內終端氨基酸標記的定量蛋白質組學方法，其特征在于所述細胞培養基的配制中重/正常精氨酸、重/正常賴氨酸和脯氨酸的終濃度分別為80-90、140-150和195-205μg/ml。

3.根據權利要求1或2所述體內終端氨基酸標記的定量蛋白質組學方法，其特征在于所述從重賴氨酸標記的細胞中提取出的全蛋白和從重精氨酸標記的細胞中提取出的全蛋白混合時按照的不同質量比為1:1、1:5、1:10和5:1。

4.根據權利要求1或2所述的體內終端氨基酸標記的定量蛋白質組學方法，其特征在于所述樣品前處理的條件為：在25-100mM，100-500ul碳酸氫銨水溶液中，分別溶解不同質量比的蛋白混合物300-800ug，依次加入二硫蘇糖醇和碘乙酰胺，使其終濃度分別為9-10mM和50-55mM，還原烷基化之后，冰丙酮沉淀得到蛋白，再重溶于25-100mM，pH=9-9.5的碳酸氫銨水溶液中，然后加入特異性內切酶Lys-N進行酶解，酶解條件為：蛋白質和酶的質量比為85:1，37℃條件下反應12-15小時，反應結束后凍干，將凍干粉重新溶解于25-100mM，pH=7-8的碳酸氫銨水溶液中，加入特異性內切酶Arg-C進行酶解，酶解條件為：蛋白質和酶的質量比為200:1，37℃條件下反應16-18小時，反應結束后凍干，將凍干粉重新溶解于體積比為20-25%乙腈、75-80%的10-20mM磷酸二氫鉀溶液中。

5.根據權利要求1或2所述的體內終端氨基酸標記的定量蛋白質組學方法，其特征在于：

所述強陽離子交換液相色譜的分析條件為：使用Poly?SULFOETHYL?A柱子，柱子規格為：內徑1-5mm、柱長100-300mm、填料粒徑3-5μm、填料孔徑80-200?；流動相A為：體積比為20-25%乙腈、75-80%?10-20mM磷酸二氫鉀溶液，流動相B為：體積比為20-25%乙腈、75-80%?300-350mM氯化鉀和10-20mM磷酸二氫鉀的溶液；洗脫條件為：起始流動相B濃度為0-5%，洗脫梯度為0.5-1%流動相B每分鐘，流速保持150-250μl/min；紫外檢測波長為214nm；

所述反相液相色譜的分析條件為：使用Captrap?Peptide柱子，柱子規格為：內徑0.075-0.1mm、柱長100-250mm、填料粒徑1-3μm、填料孔徑60-90?；流動相A為：體積比為0.05-0.1%甲酸的純水溶液；流動相B為：體積比為0.05-0.1%甲酸的純乙腈溶液；洗脫條件為：起始流動相B濃度為0-5%，洗脫梯度為0.5-1%流動相B每分鐘，流速保持200-600nl/min；

所述質譜LTQ-Orbitrap的分析條件為：噴霧電壓為1.5-3.5kV；質量掃描范圍為m/z?400-2000；Orbitrap一級質譜分辨率為60,000-100,000（m/z=400）；4-10個連續的LTQ-MS/MS掃描；歸一化碰撞能量為30-40%；q值為0.25。