[發(fā)明專利]家蠶中部絲腺細(xì)胞合成分泌溶菌酶的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110123584.8
• 申請(qǐng)日: 2011-05-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102226202A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鐘伯雄;危浩;莊蘭芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;A01K67/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 林懷禹

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建一種家蠶中部絲腺細(xì)胞合成分泌溶菌酶的方法。

背景技術(shù)

溶菌酶(Lysozyme)又稱為胞壁質(zhì)酶，分子由129個(gè)氨基酸組成，分子量約1?5?KDa，等電點(diǎn)約10.8。溶菌酶廣泛存在于家禽和鳥(niǎo)類的蛋清中，存在于哺乳動(dòng)物的眼淚、唾液、心、肺、肝、腎等液體及器官中，存在于大麥、蕪青、無(wú)花果等植物中。其中以蛋清中的含量最高，約含0．3％，而人乳、眼淚、唾液中的活性最高，高于蛋清中的酶活性3倍。

溶菌酶是一種專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，它破壞微生物細(xì)胞壁，引起細(xì)菌裂解，具有防腐和殺菌作用。而人和動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，故溶菌酶對(duì)人和動(dòng)物細(xì)胞無(wú)毒性作用，被廣泛用于醫(yī)療、食品、畜牧和生物工程等領(lǐng)域。如醫(yī)學(xué)上利用溶菌酶抗炎、消腫，增強(qiáng)免疫力。食品上利用溶菌酶作為保健食品添加劑，用于水產(chǎn)類熟制品、肉類制品的防腐和保鮮。在畜牧上用作飼料防腐劑和殺菌劑，用于家畜防治胃腸炎、消化不良等疾病。科學(xué)研究中，利用溶菌酶分解細(xì)胞壁后制備原生質(zhì)體，用于微生物育種，用于細(xì)胞融合操作。

溶菌酶價(jià)格很高，平均每公斤約2萬(wàn)元。目前溶菌酶的生產(chǎn)主要是從生物組織中提取，提取的方法主要有直接結(jié)晶法、離子交換層析法、親和層析法、超濾法、膜色譜技術(shù)(親和膜色譜，?離子交換膜色譜)?法、反膠團(tuán)蘋取法、擴(kuò)張床吸附法等。生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本高，效益低。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)溶菌酶是高效率、低成本的生產(chǎn)方法。

轉(zhuǎn)基因家蠶中部絲腺生物反應(yīng)器是在家蠶中部絲腺中表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。家蠶生長(zhǎng)周期短，50天左右可完成一個(gè)世代，每個(gè)雌蛾可產(chǎn)卵約400粒；家蠶經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)四千多年的人工馴養(yǎng)、選育，性情溫順，已完成喪失飛翔逃逸能力，而在絲蛋白合成、分泌方面具有非常強(qiáng)的能力；合成的蛋白可以隨蠶絲蛋白一起分泌到體外，蠶絲蛋白主要由3種絲素蛋白和3種絲膠蛋白構(gòu)成，成分簡(jiǎn)單。所以，轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺生物反應(yīng)器構(gòu)建容易，運(yùn)行安全，表達(dá)外源蛋白效率高，外源蛋白多具有生物活性，蛋白純化方便，只需要通過(guò)飼養(yǎng)轉(zhuǎn)基因家蠶，就可以非常方便地維持表達(dá)系統(tǒng)的延續(xù)，是一種非常有價(jià)值的表達(dá)系統(tǒng),具有廣闊的實(shí)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種家蠶中部絲腺細(xì)胞合成分泌溶菌酶的方法，利用轉(zhuǎn)基因家蠶技術(shù)將溶菌酶基因?qū)爰倚Q基因組內(nèi)，并在家蠶中部絲腺細(xì)胞中特異表達(dá)，開(kāi)發(fā)出合成分泌溶菌酶的家蠶。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案的步驟如下：

（1）采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建家蠶合成分泌溶菌酶的載體pBSer1hLYZ-A3EGFP質(zhì)粒。

（2）采用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶方法將pBSer1hLYZ-A3EGFP質(zhì)粒及能夠提供轉(zhuǎn)座酶trans的輔助質(zhì)粒導(dǎo)入家蠶受精卵內(nèi)，蠶卵孵化后飼養(yǎng)至成蟲(chóng)，自交續(xù)代為G1代，在G1代轉(zhuǎn)基因家蠶的小蠶期，通過(guò)熒光體視顯微鏡觀察選擇表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲(chóng)與絲膠蠶雜交續(xù)代為G2代，G2代以后再與絲膠蠶回交3-5代，以表達(dá)EGFP標(biāo)志基因及絲膠蠶性狀為每代的留種篩選標(biāo)志。

（3）與絲膠蠶多次回交后的蠶，再采用自交的方法使溶菌酶基因純合，采用轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)熒光基因表達(dá)相對(duì)量無(wú)損傷測(cè)定方法選擇溶菌酶基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶，育成中部絲腺細(xì)胞能夠合成分泌溶菌酶、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種。

所述的pBSer1hLYZ-A3EGFP質(zhì)粒是以piggyBac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒為基礎(chǔ)，質(zhì)粒帶有Amp抗性基因以用于質(zhì)粒的擴(kuò)增和篩選，包含?piggyBac轉(zhuǎn)座子的2個(gè)轉(zhuǎn)座臂PBL和PBR，包含?2個(gè)功能表達(dá)框，一個(gè)是A3啟動(dòng)子啟動(dòng)的綠色熒光蛋白基因表達(dá)框A3?Promoter+EGFP+SV40，以用作轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性家蠶的篩選標(biāo)志，另一個(gè)是家蠶絲膠蛋白1啟動(dòng)子、帶有便于提純外源蛋白的His接頭以及溶菌酶基因的表達(dá)框Ser1?Promoter?+His+hLYZ+SV40，以表達(dá)溶菌酶，輔助質(zhì)粒包含Amp抗性基因、piggyBac轉(zhuǎn)座子的1個(gè)轉(zhuǎn)座臂PBR、A3啟動(dòng)子啟動(dòng)的轉(zhuǎn)座酶trans基因表達(dá)框A3?Promoter+?trans，以提供轉(zhuǎn)座酶。

所述的以絲膠蠶性狀為每代的留種篩選標(biāo)志，其篩選的時(shí)期是蠶繭時(shí)期。

本發(fā)明具有的有益效果是：