[發明專利]家蠶中部絲腺細胞合成分泌溶菌酶的方法

有效

• 申請號: 201110123584.8
• 申請日: 2011-05-13
• 公開（公告）號: CN102226202A
• 公開（公告）日: 2011-10-26
• 發明（設計）人: 鐘伯雄;危浩;莊蘭芳
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林懷禹

1.一種家蠶中部絲腺細胞合成分泌溶菌酶的方法，其特征在于該方法的步驟如下：

（1）采用分子生物學技術構建家蠶合成分泌溶菌酶的載體pBSer1hLYZ-A3EGFP質粒；

（2）采用顯微注射轉基因家蠶方法將pBSer1hLYZ-A3EGFP質粒及能夠提供轉座酶trans的輔助質粒導入家蠶受精卵內，蠶卵孵化后飼養至成蟲，自交續代為G1代，在G1代轉基因家蠶的小蠶期，通過熒光體視顯微鏡觀察選擇表達EGFP標志基因的轉基因家蠶，飼養至成蟲與絲膠蠶雜交續代為G2代，G2代以后再與絲膠蠶回交3-5代，以表達EGFP標志基因及絲膠蠶性狀為每代的留種篩選標志；

（3）與絲膠蠶多次回交后的蠶，再采用自交的方法使溶菌酶基因純合，采用轉基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法選擇溶菌酶基因純合的轉基因家蠶，育成中部絲腺細胞能夠合成分泌溶菌酶、基因純合的轉基因家蠶新品種。

2.根據權利要求1所述的一種家蠶中部絲腺細胞合成分泌溶菌酶的方法，其特征在于：所述的pBSer1hLYZ-A3EGFP質粒是以piggyBac轉座質粒為基礎，質粒帶有Amp抗性基因以用于質粒的擴增和篩選，包含?piggyBac轉座子的2個轉座臂PBL和PBR，包含?2個功能表達框，一個是A3啟動子啟動的綠色熒光蛋白基因表達框A3?Promoter+EGFP+SV40，以用作轉基因陽性家蠶的篩選標志，另一個是家蠶絲膠蛋白1啟動子、帶有便于提純外源蛋白的His接頭以及溶菌酶基因的表達框Ser1?Promoter?+His+hLYZ+SV40，以表達溶菌酶，輔助質粒包含Amp抗性基因、piggyBac轉座子的1個轉座臂PBR、A3啟動子啟動的轉座酶trans基因表達框A3?Promoter+?trans，以提供轉座酶。

3.根據權利要求1所述的一種家蠶中部絲腺細胞合成分泌溶菌酶的方法，其特征在于：所述的以絲膠蠶性狀為每代的留種篩選標志，其篩選的時期是蠶繭時期。