[發明專利]基于基因沉默技術的灰飛虱致死基因片段Chitinase及其dsRNA

無效

• 申請號: 201110123038.4
• 申請日: 2011-05-12
• 公開（公告）號: CN102220343A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發明（設計）人: 李飛;李國清;董雙林;韓召軍;姜衛華
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/113;C12N15/10;A01K67/033
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤

技術領域

本發明屬于農業生物技術領域，涉及基于基因沉默技術的灰飛虱致死基因片段Chitinase及其dsRNA。

背景技術

在我國，化學藥劑連續單一長期使用已導致灰飛虱對多種農藥產生了不同程度的抗性，需要不斷加大農藥使用量才能達到滿意的防治效果，造成了更為嚴重的環境污染，形成惡性循環。另外灰飛虱傳播條紋病毒引起的水稻條紋葉枯病，發病后藥劑控制效果較差，只能依靠治蟲防病。因此，在農業生產實踐中，急需化學農藥之外的替代防治手段。

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)是一種由雙鏈RNA介導的基因沉默現象，雙鏈RNA最終被加工大小約為22nt的小RNA(siRNA)，通過序列配對的方式與蛋白編碼基因結合，根據序列配對的程度降解靶標基因mRNA或抑制基因的蛋白翻譯過程。RNAi廣泛地存在于真菌、植物和動物中。2006年Andre?Fire和Craig?Mello因發現RNAi現象被授予諾貝爾醫學與生理獎。

在生物體中，一些重要的基因對維持生命是必須的。因此，從理論上而言，如果利用RNA干擾技術將農業害蟲中重要基因的表達進行干擾，則會引起害蟲的致畸或致死，從而達到控制害蟲的目的。本專利發明就是利用實驗室改進的dsRNA喂食法從灰飛虱中篩選出經干擾后能夠導致灰飛虱死亡的重要基因，為建立利用RNA干擾技術控制害蟲的新策略提供序列和數據基礎。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種灰飛虱致死基因片段Chitinase及其克隆方法。

本發明的另一方法是提供該致死基因片段Chitinase的dsRNA及其合成方法。

本發明的又一目的是提供一種用于篩選致死基因的dsRNA喂食法。

本發明的目的可通過如下技術方案實現：

灰飛虱致死基因片段Chitinase，序列如SEQ?ID?NO.1所示。

所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase的克隆方法，包括如下步驟：

(1)取灰飛虱，提取總RNA，以提取的灰飛虱總RNA合成cDNA第一條鏈；

(2)以步驟(1)合成的灰飛虱cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQ?ID?NO.2的上游引物P1、序列為SEQ?ID?NO.3的下游引物P2進行RT-PCR擴增；

(3)PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標DNA片段；

(4)將回收的目標DNA片段在T3連接酶作用下插入至pEASY-T3載體中，轉化到大腸桿菌T1，涂于含有X-gal、IPTG以及氨芐青霉素的LB培養基，37℃培養，過夜；

(5)通過挑選白色單菌落，篩選陽性重組子；

(6)用含氨芐青霉素的LB培養液將重組子擴增，提取克隆質粒；

(7)全自動序列儀進行測序，得到SEQ?ID?NO.1所示的Chitinase基因片段。

其中，所述的RT-PCR擴增體系為：反應緩沖液5μL，Mg²⁺4μL，dNTP?4μL，cDNA模板2μL，上游引物P1?1μL，下游引物P2?1μL，R-Tag酶0.5μL，ddH₂O?32.5μL，共50μL；所述的反應程序為：94℃變性2min，94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35個循環，72℃延伸。

灰飛虱致死基因片段Chitinase的dsRNA，序列如SEQ?ID?NO.4所示。

所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase的dsRNA的合成方法，是以灰飛虱cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQ?ID?NO.5的上游引物P3、序列為SEQ?ID?NO.6的下游引物P4PCR擴增得到灰飛虱致死基因片段Chitinase的dsRNA。

所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase的dsRNA的合成方法優選包含如下步驟：

(1)根據已經驗證的Chitinase基因片段序列，設計并合成序列為SEQ?ID?NO.5的引物3和序列為SEQ?ID?NO.6的引物4，以灰飛虱cDNA第一條鏈為模板PCR擴增得到灰飛虱致死基因片段Chitinase的dsRNA，PCR體系為：反應緩沖液5μL，Mg²⁺4μL，dNTP?4μL，cDNA模板2μL；上游引物P3?2μL，下游引物P4?2μL，Ex?Tap酶0.25μL，ddH₂O?30.75μL，共50μL；PCR條件為：94℃變性2min，94℃30sec，55-62℃30sec，72℃30sec，38個循環，72℃延伸。