[發(fā)明專利]基于基因沉默技術(shù)的灰飛虱致死基因片段Chitinase及其dsRNA

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110123038.4
• 申請(qǐng)日: 2011-05-12
• 公開（公告）號(hào): CN102220343A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李飛;李國(guó)清;董雙林;韓召軍;姜衛(wèi)華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/113;C12N15/10;A01K67/033
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤

1.灰飛虱致死基因片段Chitinase，其特征在于序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.權(quán)利要求1所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase的克隆方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)取灰飛虱，提取總RNA，以提取的灰飛虱總RNA合成cDNA第一條鏈；

(2)以步驟(1)合成的灰飛虱cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQ?ID?NO.2的上游引物P1、序列為SEQ?ID?NO.3的下游引物P2進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；

(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)DNA片段；

(4)將回收的目標(biāo)DNA片段在T3連接酶作用下插入至pEASY-T3載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T1，涂于含有X-gal、IPTG以及氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，過夜；

(5)通過挑選白色單菌落，篩選陽(yáng)性重組子；

(6)用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液將重組子擴(kuò)增，提取克隆質(zhì)粒；

(7)全自動(dòng)序列儀進(jìn)行測(cè)序，得到SEQ?ID?NO.1所示的Chitinase基因片段。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase的克隆方法，其特征在于所述的RT-PCR擴(kuò)增體系為：反應(yīng)緩沖液5μL，Mg2+4μL，dNTP?4μL，cDNA模板2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，R-Tag酶0.5μL，ddH2O?32.5μL，共50μL；所述的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性2min，94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸。

4.權(quán)利要求1所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase的dsRNA，其特征在于序列如SEQ?ID?NO.4所示。

5.權(quán)利要求4所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase的dsRNA的合成方法，其特征在于：以灰飛虱cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQ?ID?NO.5的上游引物P3、序列為SEQ?ID?NO.6的下游引物P4PCR擴(kuò)增得到灰飛虱致死基因片段Chitinase的dsRNA。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase的dsRNA的合成方法，其特征在于包含如下步驟：

(1)根據(jù)已經(jīng)驗(yàn)證的Chitinase基因片段序列，設(shè)計(jì)并合成序列為SEQ?ID?NO.5的P3和序列為SEQ?ID?NO.6的P4，以灰飛虱cDNA第一條鏈為模板PCR擴(kuò)增得到灰飛虱致死基因片段Chitinase的dsRNA，PCR體系為：反應(yīng)緩沖液5μL，Mg²⁺4μL，dNTP?4μL，cDNA模板2μL；上游引物2μL，下游引物2μL，ExTap酶0.25μL，ddH₂O?30.75μL，共50μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性2min，94℃30sec，55-62℃30sec，72℃30sec，38個(gè)循環(huán)，72℃延伸；

(2)PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為1％的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離；

(3)回收目標(biāo)DNA產(chǎn)物。

7.一種灰飛虱的dsRNA喂食方法，其特征在于包含如下步驟：

(1)將玻璃管的一端封好，用吸蟲器吸取二齡的灰飛虱加入玻璃管內(nèi)，用紗布將玻璃管另一端封好；

(2)將蟲子拍打至玻璃管封口端，將另一端的紗布取下，將已經(jīng)準(zhǔn)備好的封口膜，貼紙的一面朝上，蓋到玻璃管管口上，將管豎立放置；

(3)用移液槍吸取含dsRNA的飼料滴在膜的中央，用一個(gè)新的封口膜，貼紙的一面朝下，貼在玻璃管管口上，將飼料和dsRNA封在兩層封口膜之間；

(4)將加好飼料和dsRNA的玻璃管放回養(yǎng)蟲室的養(yǎng)蟲架上，房間溫度為26℃，利用灰飛虱的趨光習(xí)性僅在飼料端給予光照，使其趨食飼料，每24h換一次含dsRNA的飼料。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的dsRNA喂食方法，其特征在于所述的dsRNA為權(quán)利要求4所述的灰飛虱致死基因片段Chitinase的dsRNA。