[發(fā)明專利]一種利用檸檬酸發(fā)酵液為原料發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110122352.0
• 申請日: 2011-05-11
• 公開（公告）號: CN102242160A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李榮杰;穆曉玲;李維理;唐浩
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司
• 主分類號: C12P7/46
• 分類號: C12P7/46;C12N9/02;C12R1/01
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用檸檬酸發(fā)酵液為原料發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的方法。

背景技術(shù)

L-蘋果酸是生物體糖代謝過程中產(chǎn)生的一種重要有機酸，廣泛存在于水果及蔬菜中，是一種優(yōu)良的酸味劑和保鮮劑，主要運用于食品、化工、醫(yī)藥、日化及保健等，用其合成的尿素L-蘋果酸還可用于非線性光學(xué)有機材料。

近年來，L-蘋果酸市場逐漸啟動，需要快速增加，已呈現(xiàn)嚴(yán)重供不應(yīng)求的局面。由于用天然產(chǎn)物提取或者化學(xué)合成的來生產(chǎn)蘋果酸的方法成本過高，因此用微生物的方法合成L-蘋果酸是今后大規(guī)模生產(chǎn)的趨勢。目前用微生物合成L-蘋果酸的菌種繁多，但大致可以分為四類：

1.由絲狀菌和酵母菌發(fā)酵，由多糖降解成L-蘋果酸。

2.培養(yǎng)細菌，由菌體內(nèi)的延胡索酸酶將加入的延胡索酸轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸

3.將含延胡索酸的菌體細胞固定化，或從細胞中提取出延胡索酸酶制成固定化酶之后，再將延胡索酸轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸。

4.先培養(yǎng)根酶將葡萄糖降解成延胡索酸，再接入普通變形桿菌混合培養(yǎng)，將延胡索酸轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸。

其中，第2種方法是目前用于L-蘋果酸生產(chǎn)的主要方法。但由于延胡索酸酶的制備培養(yǎng)基通常以檸檬酸為碳源，而成品檸檬酸的價格較高，從而導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種利用檸檬酸發(fā)酵液為原料發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的方法。

本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其為以檸檬酸發(fā)酵液為碳源，發(fā)酵產(chǎn)延胡索酸酶菌株生成延胡索酸酶，再用延胡索酸酶的發(fā)酵液轉(zhuǎn)化富馬酸鈉生成蘋果酸。

其中，所述的發(fā)酵產(chǎn)延胡索酸酶菌株的培養(yǎng)基為：檸檬酸發(fā)酵液20～25wt％、MgSO₄0.02～0.05wt％、玉米漿3.5～4.5wt％、KH₂PO₄0.2～0.4wt％、NH₃·H₂O?3～5wt％。

其中，所述的檸檬酸發(fā)酵液中檸檬酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10～15％。

其中，可通過本領(lǐng)域公知的方法發(fā)酵黑曲霉，獲得檸檬酸發(fā)酵液。優(yōu)選可參看CN101638675的方法發(fā)酵產(chǎn)程檸檬酸發(fā)酵液。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選當(dāng)延胡索酸酶的酶活力為21000～24000μmol/g·h時，停止發(fā)酵產(chǎn)延胡索酸酶菌株。其中，優(yōu)選的發(fā)酵溫度為34～36℃，發(fā)酵時間為20～40h。

根據(jù)本發(fā)明，在產(chǎn)延胡索酸酶菌株發(fā)酵過程中，優(yōu)選的發(fā)酵液體積和無菌空氣的通氣量之比為1∶0.5-0.9。

根據(jù)本發(fā)明，可選用任何本領(lǐng)域公知的可發(fā)酵產(chǎn)生延胡索酸酶的菌株，可選自溫特曲霉、產(chǎn)氨短桿菌、普通變形桿菌、黃色短桿菌或其組合，優(yōu)選的菌株為產(chǎn)氨短桿菌菌株M13(保藏號為CICC?10169)。

根據(jù)本發(fā)明，將含有延胡索酸酶的發(fā)酵液轉(zhuǎn)化富馬酸鈉，生成L-蘋果酸，其中含有延胡索酸酶的發(fā)酵液和富馬酸鈉的混合液中延胡索酸酶酶活為10500～13333μmol/g·h，富馬酸鈉的濃度為0.44～0.83mol/L。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的轉(zhuǎn)化L-蘋果酸的溫度為37-40℃，轉(zhuǎn)化時間為20-26小時。

本發(fā)明針對延胡索酸酶發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的成品檸檬酸價格較高的問題，采用按一定比例的檸檬酸發(fā)酵液來代替成品檸檬酸的添加，使得生產(chǎn)成本最低化，并建立了相應(yīng)的檸檬酸發(fā)酵液預(yù)處理辦法與酶發(fā)酵生產(chǎn)代謝控制技術(shù)；本發(fā)明利用檸檬酸發(fā)酵液為碳源，對其他培養(yǎng)基成分也進行了優(yōu)化，并且對酶發(fā)酵過程和酶轉(zhuǎn)化工藝也做出了相應(yīng)的改進，最后得到的較高的L-蘋果酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，對與L-蘋果酸的大規(guī)模生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實意義。

具體實施方法

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

按照CN101638675公開的方法，發(fā)酵黑曲霉獲得檸檬酸發(fā)酵液，發(fā)酵液中檸檬酸的含量為12％，將其經(jīng)板框過濾器進行壓濾，除去發(fā)酵液中的菌絲等固態(tài)雜質(zhì)后，收集發(fā)酵液。

實施例2