[發明專利]一種利用LAMP快速檢測中國番木瓜曲葉病毒的方法

有效

• 申請號: 201110119658.0
• 申請日: 2011-05-10
• 公開（公告）號: CN102154526A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 季英華;周益軍;程兆榜;周彤;楊杰;周曉偉;蔡振東;劉莉
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種快速檢測中國番木瓜曲葉病毒的方法，屬植物保護領域。

背景技術

中國番木瓜曲葉病毒(Papaya?leaf?curl?china?virus，PaLCCNV)是一種重要的植物病毒，屬于雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬，傳播介體為煙粉虱。該病毒最早是在我國廣西的番木瓜上檢測到的，所以稱為中國番木瓜曲葉病毒，除危害番木瓜外，該病毒也危害番茄等作物，主要表現葉片變小，上卷，葉緣及葉脈之間黃化，植株矮化等癥狀，對番茄的產量和質量影響嚴重。2007年該病在河南番茄上大面積發生危害，僅開封市開封縣就有2000個日光溫室受到毀滅性的危害，直接經濟損失近2000萬元。2009年在江蘇等地作物上也有檢測到，顯示該病毒也有蔓延擴散的跡象，是一個潛在的威脅。

環介導恒溫核酸擴增技術(loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)最早是由Notomi?T等在2000年發明的，是一種基于高靈敏鏈置換技術的恒溫核酸擴增方法，其工作原理為：針對靶基因的6個區域設計了4個特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶——Bst(Bacillus?stearothermophilus)DNA?polymerase在恒溫(65℃)的條件下反應1小時即可完成核酸擴增反應，反應產物既可通過電泳紫外觀察，亦可通過熒光染色直接目測。該方法操作簡便，無需特殊儀器(PCR儀)，而檢測結果準確，是一種快捷而有效的檢測方法。目前已廣泛應用于人類和動植物各種病毒、細菌、寄生蟲等引起的疾病檢測和快速診斷。

目前在中國番術瓜曲葉病毒的檢測上，較常用的方法有兩種，一種是分子生物學檢測方法，其中以PCR最為常見，但是PCR需要30-35個循環反應(較費時)及特殊的儀器(PCR儀)；另一種是血清學檢測方法，常見的有ELISA及DIBA等，血清學檢測方法除了在靈敏度上存在不足外，其檢測的特異性也受到限制(菜豆金色花葉病毒屬成員間的核苷酸同源性相對較高)。而LAMP方法很好的克服了當前這兩類方法的不足(反應時間短，無需特殊儀器，檢測靈敏度高，特異性好)，目前尚未見到使用該方法檢測中國番木瓜曲葉病毒的方法。LAMP方法既保證了檢測的靈敏性和特異性，同時又簡化了操作，節省了成本，為今后該病害的調查提供了一種簡單而有效的方法。

發明內容

本發明克服了現有技術中的缺點，為中國番木瓜曲葉病毒的檢測提供了一種快速、簡便、靈敏的方法。

1、引物設計：

根據NCBI上已報道的中國番木瓜曲葉病毒核酸序列設計引物，引物序列如下：

P-F3：5`-CAAACTTCCCTATGCAATCG-3`

P-B3：5`-GATTTGAATTAAATAGGCTTTGAGG-3`

P-FIP：5`GCCGCTTTTGGATTTTGAATTTTGA-ATGGGTCCTTATTTATATGTGAG-3`

P-BIP：5`-TCCGTATAATATTACCGGATGGCC-GTTTTAAATGGAGGACATTTCTTTG-3`

2、總DNA提取：

取10mg番茄病葉于1.5mL離心管，加100μL?0.5mol/LNaOH，勻漿后5000rpm離心5min，上清液用0.1mol/L?Tris-HCl(pH8.0)稀釋100倍，取1μL作為模板進行PCR擴增。

3、PCR擴增：

反應體系：總體系為25μL，其中DNA?2μL，Bst?DNA聚合酶(8U/μL)1μL，其它組分終濃度分別為P-F3和P-B30.2μmol/L；P-FIP和P-BIP?1.6μmol/L；Betaine?0.8mol/L；dNTPs?1.4mmol/L，1倍的Thermopolbuffer(含MgSO42mmol/L)；MgCl₂8mmol/L。

反應條件：65℃恒溫水浴鍋60min；80℃5min。

4、檢測：

電泳檢測：取10μL產物經1％瓊脂糖凝膠在0.5×TBE緩沖液和120V電壓條件下電泳40min，在0.5μg/mL的溴化乙錠(EB)中染色10min，染色后于凝膠成像系統中觀察，在感染中國番木瓜曲葉病毒的樣品中可以觀察到明亮的呈彌散狀的核酸泳帶。

熒光染料：LAMP反應結束后，向其產物中加入SYBR?Greenl(1∶1000)2μl，1-5min后察結果，感染中國番木瓜曲葉病毒的樣品變成綠色，而未感染樣品及空白對照保持染料的橙色。

其中所述的65℃的反應溫度，也可以是63-65℃