[發明專利]一種利用LAMP快速檢測中國番木瓜曲葉病毒的方法

有效

• 申請號: 201110119658.0
• 申請日: 2011-05-10
• 公開（公告）號: CN102154526A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 季英華;周益軍;程兆榜;周彤;楊杰;周曉偉;蔡振東;劉莉
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用LAMP快速檢測中國番木瓜曲葉病毒的方法，包括以下步驟：

(1)引物設計：

根據NCBI上已報道的中國番木瓜曲葉病毒核酸序列設計引物，引物序列如下：

P-F3：5`-CAAACTTCCCTATGCAATCG-3`

P-B3：5`-GATTTGAATTAAATAGGCTTTGAGG-3`

P-FI?P：5`-GCCGCTTTTGGATTTTGAATTTTGA-ATGGGTCCTTATTTATATGTGAG-3`

P-BI?P：5`-TCCGTATAATATTACCGGATGGCC-GTTTTAAATGGAGGACATTTCTTTG-3`

(2)總DNA提?。?/p>

取10mg番茄病葉于1.5mL離心管，加100μL?0.5mol/L?NaOH，勻漿后5000rpm離心5min，上清液用0.1mol/L?Tris-HCl(pH8.0)稀釋100倍，取1μL作為模板進行PCR擴增。

(3)LAMP反應：

反應體系：總體系為25μL，其中DNA?2μL，Bst?DNA聚合酶(8U/μL)1μL，其它組分終濃度分別為P-F3和P-B30.2μmol/L；P-FIP和P-BIP?1.6μmol/L；Betaine?0.8mol/L；dNTPs?1.4mmol/L，1倍的Thermopolbuffer(含MgSO42mmol/L)；MgCl₂8mmol/L。

反應條件：65℃恒溫水浴鍋60min；80℃5min。

(4)檢測：

電泳檢測：取10μL產物經1％瓊脂糖凝膠在0.5×TBE緩沖液和120V電壓條件下電泳40min，在0.5μg/mL的溴化乙錠(EB)中染色10min，染色后于凝膠成像系統中觀察，在感染中國番木瓜曲葉病毒的樣品中可以觀察到明亮的呈彌散狀的核酸泳帶。

熒光染料：LAMP反應結束后，向其產物中加入SYBR?GreenI(1∶1000)2μl，1-5min后察結果，感染中國番木瓜曲葉病毒的樣品變成綠色，而未感染樣品及空白對照保持染料的橙色。

2.根據權利要求1所述的利用LAMP快速檢測中國番木瓜曲葉病毒的方法，其特征在于LAMP擴增中的反應溫度為62-65℃。

3.根據權利要求1所述的利用LAMP快速檢測中國番木瓜曲葉病毒的方法，其特征在于鎂離子的終濃度為10mmol/L。