[發明專利]一種檢測RNA病毒hMPV的方法、試劑盒及應用

無效

• 申請號: 201110115340.5
• 申請日: 2011-06-16
• 公開（公告）號: CN102827946A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 鄭麗舒;王翔;侯云德
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所;北京金迪克生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京元中知識產權代理有限責任公司 11223
• 代理人: 王明霞

技術領域

本發明涉及一種檢測RNA病毒hMPV的方法及試劑盒，具體講涉及一種利用逆轉錄等溫擴增技術檢測RNA病毒hMPV的方法及試劑盒。

背景技術

RT-LAMP技術是在實驗過程中使核酸鏈通過在等溫環境中的循環置換擴增實現對靶序列的放大，而達到檢測的目的。由于反應中使用了三對特異性引物，只有在三對引物均與特異的靶序列結合時擴增反應才能進行，因此這種檢測方法的特異性很高。其中一對特殊的引物的5’端含有一端與下游擴增產物互補的序列，因此，這對引物的單鏈產物就可形成一個類似啞鈴狀回文結構，這種結構正好為下一步等溫置換擴增反應提供了一個可被周而復始利用的模板，從而保證了擴增的持續進行，最終，擴增產物在核酸電泳膠上形成連續的梯狀條帶。

從RT-LAMP的原理和特點不難看出，該方法在RNA病毒的檢測方面應該有著傳統基因診斷方法無法比擬的優勢，與一些常規的基因檢測手段相比，該技術在可操作性和檢測時間及設備要求方面具有更大的優勢。這主要體現在以下幾個方面。首先，它的檢測時間可以縮短到兩小時以內，靈敏度可達到檢測十個拷貝以上的病毒核酸分子。除了應用一些常用聚合酶外，對硬件設備基本無特殊要求，在普通的生物實驗室就可完成這項檢測工作。在試驗實施中只需一步就可完成實驗操作，減少了污染機會并方便了實驗過程中的質控工作。第二，該技術省略了單獨的逆轉錄和巢式PCR的二次擴增步驟，加之擴增反應在65℃等溫條件下進行，沒有核酸的變復性過程，不但節省了大量的時間又減少了RNA酶和擴增核酸的污染機會。第三，擴增反應只有在六條引物完全與識別的靶序列中八個結合區匹配的情況下才能順利進行，所有這些特性都在很大程度上減少了擴增反應的背景，從而使檢測特異性得到改善。第四，RT-LAMP的擴增反應中可以形成可視的焦磷酸鎂沉淀，因此肉眼也可觀察到陽性反應管中的白色混濁物。

人偏肺病毒(human?metapneumovirus，hMPV)是2001年首次由荷蘭科學家發現的一種新型呼吸道病原。該病毒屬于副粘病毒科肺病毒亞科偏肺病毒屬成員，是一種單股負鏈RNA病毒，基因全長約13.4kb。到目前為止，hMPV已經在北美洲，南美洲，歐洲，亞洲，非洲和大洋洲全球許多國家和地區的急性呼吸道感染患者中檢出。血清學研究發現，在荷蘭幾乎所有兒童都曾經感染過hMPV或是處在該病毒的威脅之下，該病毒在人群當中的傳播至少已有50年之久。hMPV可導致各年齡段急性呼吸道感染，臨床表現與人呼吸道合胞病毒所致疾病相似，由于流行季節與RSV相似，故經常與RSV合并感染，造成急性呼吸道疾病。重癥患者多為嬰幼兒、老年人及心肺疾病者。2003年我國學者在北京地區嬰幼兒呼吸道感染患者中的存在。但我國相關hMPV的報道尚不多見，主要原因是缺乏針對該病毒靈敏、特異、快速、有效的檢測手段。為了更加深入了解該病毒感染的流行病學特點，發病機理及臨床表現等情況，需要建立針對該病毒快速靈敏有效的實驗室診斷方法。目前hMPV的檢測方法有病毒分離、RT-PCR、巢式PCR、Real-time?PCR、酶聯免疫、單抗與免疫熒光結合等。但是常用的核酸和抗體檢測的缺點是檢測試劑和儀器成本要求較高，病毒分離時間長或者不能分離，這遠遠不能滿足實際工作中高通量高效率的要求，對于病毒病的預防控制受到一定限制。因此，利用LAMP方法檢測特異性強，所用時間短，所需成本低，結果又可視性的特點，開發針對hMPV的LAMP檢測方法，對于進行大規模流行病學研究和基層的現場檢測是非常有意義的。

發明內容

本發明的首要發明目的在于提出一種利用逆轉錄等溫擴增技術檢測RNA病毒hMPV的方法。

本發明的第二發明目的在于提出一種檢測RNA病毒hMPV的試劑盒。

本發明的第三發明目的在于提出該檢測RNA病毒hMPV的試劑盒的用途。

為了實現本發明的發明目的，采用的技術方案為：

本發明提出了一種利用逆轉錄等溫擴增技術檢測RNA病毒hMPV的方法，包括以下步驟：根據人偏肺病毒的N基因的相對保守區，分別設計了六條引物，包括兩條外引物F3、B3和兩條內引物FIP、BIP，兩條環結合引物LF、LB；處理待測標本，提取樣本的RNA后，進行RT-LAMP反應；然后通過電泳檢測或肉眼觀察，最終得到實驗結果；

其中，所述的引物的核苷酸序列為：

外引物F3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，或由SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；