[發明專利]一種檢測RNA病毒hMPV的方法、試劑盒及應用

無效

• 申請號: 201110115340.5
• 申請日: 2011-06-16
• 公開（公告）號: CN102827946A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 鄭麗舒;王翔;侯云德
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所;北京金迪克生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京元中知識產權代理有限責任公司 11223
• 代理人: 王明霞

1.一種利用逆轉錄等溫擴增技術檢測RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，所述的檢測方法包括以下步驟：根據人偏肺病毒的N基因的相對保守區，分別設計了六條引物，包括兩條外引物F3、B3和兩條內引物FIP、BIP，兩條環結合引物LF、LB；處理待測標本，提取樣本的RNA后，進行RT-LAMP反應；然后通過電泳檢測或肉眼觀察，最終得到檢測結果；

其中，所述的引物的核苷酸序列為：

外引物F3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，或由SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；，

外引物B3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，或由SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列：

內引物FIP(F1c+F2)的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示，或由SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列：

內引物BIP(B1c+B2)的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示，或由SEQ?ID?NO：4所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列：

環引物LF的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：5所示，或由SEQ?ID?NO：5所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列：

環引物LB的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：6所示，或由SEQ?ID?NO：6所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的利用逆轉錄等溫擴增技術檢測RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，所述RT-LAMP的反應體系為：

Bst?DNA聚合酶緩沖液(10×)，2.5μl；

BstDNA聚合酶(8u/μl)，1μl；

AMV反轉錄酶(10u/μl)，1μl；

dNTP(10mM)，2.5μl；

Betaine(25mM)，1μl；

MgCl₂(150mM)，1μl；

外引物F3、B3(5μM)，各1μl；

內引物FIP、BIP(10μM)，各1μl；

環引物LF、LB(20μM)，各1μl；

DNA，1μl；

ddH₂O，9μl；

總體積25μl。

3.根據權利要求1所述的利用逆轉錄等溫擴增技術檢測RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，所述RT-LAMP的反應條件為60～68℃恒溫反應1～2h，優選65℃恒溫1.5h；然后75～85℃滅活3～10min，優選80℃滅活5min。

4.根據權利要求1所述的利用逆轉錄等溫擴增技術檢測RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，所述提取樣本RNA的方法為：以hMPV陽性RNA核酸為模板，使用兩步法反轉錄試劑盒先進行第一步反轉錄以獲取cDNA；以cDNA為模板并RT-PCR引物進行PCR反應，擴增條件為：95℃預變性5min，95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，35個循環，72℃延伸10min，4℃保存；

其中，RT-PCR引物F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：7所示，或由SEQ?ID?NO：7所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；

RT-PCR引物R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：8所示，或由SEQ?ID?NO：8所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。

5.根據權利要求1所述的利用逆轉錄等溫擴增技術檢測RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，所述的電泳采用1％瓊脂糖凝膠電泳，陽性結果在416bp處產生條帶。

6.根據權利要求1所述的利用逆轉錄等溫擴增技術檢測RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，采用肉眼檢測，渾濁有白色沉淀的為陽性，清亮透明的為陰性。

7.根據權利要求1所述的利用逆轉錄等溫擴增技術檢測RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，采用肉眼檢測，在RT-LAMP的反應體系加入羥基萘酚蘭，陽性反應呈藍色，陰性反應呈紫色。

8.一種檢測檢測RNA病毒hMPV的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中包括病毒RNA提取試劑盒、RT-LAMP的反應體系、定量參考品、陰性質控品、陽性質控品。