[發明專利]大豆凝集素提取純化方法

有效

• 申請號: 201110114904.3
• 申請日: 2011-05-05
• 公開（公告）號: CN102212105A
• 公開（公告）日: 2011-10-12
• 發明（設計）人: 車東升;穆成龍;劉飛飛;孫澤威;秦貴信;楊連玉;張海全;趙元;鮑男;趙晗;程傳鋒;盧加成;張春
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C07K1/22
• 分類號: C07K1/22;C07K14/42
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 修雪靜

技術領域

本發明屬生物技術領域，確切地說是大豆凝集素提取純化方法。

大豆凝集素(soybean?agglutinin，SBA)，是大豆中的一種重要的蛋白。1909年由Wienhaus首次發現，1952年由Liener和Pallansh等分離得到，1958年制備得到純品。經過長期的研究人們發現大豆凝集素是大豆中能夠特異性結合半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰基-D-半乳糖胺的四聚體糖蛋白。通常所說的大豆凝集素是指分子量為120kDa的四聚體，有兩種稍有不同的亞基組成，有兩個半乳糖結合位點，等電點為5.81，超速離心時隨著7S蛋白一起沉降。研究表明SBA的凝集活性受Ca²⁺和Mn²⁺的影響，原因是SBA的每一個亞基中含有一個Ca²⁺和Mn²⁺。研究表明，這兩個離子有先后的結合在亞基上并對其糖結合特異性有一定影響。另外含有一種分子量為175kDa的凝集素，有兩種不同的亞基構成四聚體。

現有研究表明大豆凝集素具有如下功能：1、細胞凝集活性，能夠凝集多種動物如兔、鼠、奶牛、人的紅細胞，多種動物的T淋巴細胞，小腸上皮細胞等；2、有絲分裂原活性，能夠促進淋巴細胞的有絲分裂，SBA能夠引起細胞代謝的增加，如DNA和蛋白質合成，此外，SBA還能夠促進F-actin向G-actin的轉變，影響細胞形態。3、大豆凝集素的抗營養作用，有較強的抗營養作用，主要表現在：是動物采食量降低，對動物生長性能的抑制作用，對消化道結構的破壞作用，影響消化道消化吸收功能，影響消化道內菌群的分布。

由于大豆凝集素的具有上特性，大豆凝集素的應用范圍十分廣泛，動物營養學用純品凝集素研究其對動物的抗營養作用；大豆凝集素作為識別含有半乳糖，半乳糖胺，N-乙酰氨基-D-半乳糖糖鏈的探針，用于細胞表面的糖基化模式的研究；以及對于標記癌癥的分化程度有重要作用等多個領域。目前市場對純化的大豆凝集素需求日益增加，大多依賴進口，價格也比較昂貴。

大豆凝集素傳統的純化方法包括離子交換和磷酸鈣層析。Liener和Pallansch(1952)采用等電點沉淀、硫酸銨分級沉淀法分離得到了純化的大豆凝集素。Wade等(1958)、張洪淵等(1991)采用離子交換纖維素、羥基磷灰石(HA)柱層析等方法成功進行了大豆凝集素的分離純化。親和層析也被應用于大豆凝集素的純化過程，并且純化工藝在不斷更新。

由于傳統的大豆凝集素純化方法的純化效率較低，因而人們利用大豆凝集素能于N-乙酰基-D-半乳糖胺、半乳糖等配基或配體發生特異性結合的能力制備了大豆凝集素親和純化體系。根據所采用親和介質的不同，主要分為半乳糖胺-CH-Sepharose4B、N-乙酰基-D-半乳糖胺-Sepharose6B和瓜爾膠親和層析體系。以上體系均存在一定的限制，瓜爾膠純化效率和純度較低，N-乙酰基-D-半乳糖胺-Sepharose6B由于配基N-乙酰基-D-半乳糖胺成本較高限制了其大規模使用，半乳糖胺-CH-Sepharose4B流速有一定限制。

純化過程主要包括，豆粉的脫脂，磷酸緩沖液溶解，4℃過夜，離心，硫酸銨鹽析，離心，親和層析純化等過程。這種方法純化周期較長，硫酸銨使用量大容易造成水體污染。

發明內容

本發明的目的是提供一種價格低廉、再生簡單的、流速高的純化大豆凝集素的親和層析填料。

純化大豆凝集素親和層析填料D-GalN-FF-sepharose4B，其分子式為：

純化大豆凝集素親和層析填料D-GalN-FF-sepharose4B的制備方法，它包括：

1)凝膠的溶脹與洗滌：FF-Sepharose?4B在0.5M?NaCl溶液中吸水溶脹，吸出剩下的水分，脫氣；

2)凝膠的活化：脫氣后的凝膠，懸浮于按每8-10毫升4M?NaOH溶液，加入18.00mg硼氫化鈉(NaBH₄)和5.0mL環氧氯丙烷的溶液，保持pH值在13～14，懸浮液在20～25℃下混合反應1～2h后，用2M?NaOH淋洗，用蒸餾水淋洗至中性，再用0.5M?NaOH淋洗，脫氣；

3)半乳糖胺交聯：脫氣后活化的凝膠懸浮于含有10％半乳糖氨的0.5M?NaOH溶液中，輕輕攪拌后，室溫下靜置過夜；

用0.5M?NaOH溶液淋洗，再用蒸餾水沖洗至pH達到中性，由0.15M?NaCl溶液平衡，在4℃保存備用。

本發明目的又一個目的是提供一種簡單快捷、適于規模化生產的大豆凝集素提取純化工藝。

大豆凝集素提取純化方法，它包括：