[發明專利]大豆凝集素提取純化方法

有效

• 申請號: 201110114904.3
• 申請日: 2011-05-05
• 公開（公告）號: CN102212105A
• 公開（公告）日: 2011-10-12
• 發明（設計）人: 車東升;穆成龍;劉飛飛;孫澤威;秦貴信;楊連玉;張海全;趙元;鮑男;趙晗;程傳鋒;盧加成;張春
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C07K1/22
• 分類號: C07K1/22;C07K14/42
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 修雪靜

1.純化大豆凝集素親和層析填料D-GalN-FF-sepharose4B，其分子式為：

2.純化大豆凝集素親和層析填料D-GalN-FF-sepharose4B的制備方法，它包括：

1)凝膠的溶脹與洗滌：FF-Sepharose?4B在0.5M?NaCl溶液中吸水溶脹，吸出剩下的水分，脫氣；

2)凝膠的活化：脫氣后的凝膠，懸浮于按每8-10毫升4M?NaOH溶液，加入18.00mg硼氫化鈉(NaBH₄)和5.0mL環氧氯丙烷的溶液中，保持pH值在13～14，懸浮液在20～25℃下混合反應1～2h后，用2M?NaOH淋洗，用蒸餾水淋洗至中性，再用0.5M?NaOH淋洗，脫氣；

3)半乳糖胺交聯：脫氣后活化的凝膠懸浮于含有10％半乳糖氨的0.5M?NaOH溶液中，輕輕攪拌后，室溫下靜置過夜；用0.5M?NaOH溶液淋洗，再用蒸餾水沖洗至pH達到中性，由0.15M?NaCl溶液平衡。

3.大豆凝集素提取純化方法，它包括：

1)脫脂：稱取豆粉，加入10倍質量的正己烷，室溫下攪拌1.5-2h，靜止后更換正己烷，重復上述步驟三次，風干后保存備用。

2)粗提：取脫脂豆粉，溶于40-50倍質量的蒸餾水中充分攪拌，10000～15000rpm離心10～20min。

3)過濾：離心后棄沉淀，上清經0.45μm微孔濾膜過濾后進行親和層析；

4)親和層析：取D-GalN-FF-sepharose4B裝入層析柱中，用生理鹽水平衡后，將步驟3)的粗提液加入層析柱中，用生理鹽水洗滌雜蛋白，待蛋白濃度回歸基線時，加入含0.3M半乳糖的生理鹽水洗脫大豆凝集素，自開始出現蛋白峰時收集洗脫液，直到蛋白峰回歸至基線；

5)透析：蛋白溶液裝入透析袋中用蒸餾水透析，除去NaCl；

6)濃縮：透析袋外側加入聚乙二醇以濃縮蛋白；

7)冷凍干燥。

4.根據權利要求3所述的大豆凝集素提取純化方法，其特征在于：親和層析流速為3ml/min。

5.根據權利要求3所述的大豆凝集素提取純化方法，其特征在于：使用多次的D-GalN-FF-sepharose4B用鹽酸胍、氫氧化鈉洗滌后，再生。

6.根據權利要求5所述的大豆凝集素提取純化方法，其特征在于：所述的再生，是用6M鹽酸胍洗脫2-3個柱體積，0.9％NaCl平衡3個柱體積，然后用0.5～1.5％的NaOH洗脫2～3個柱體積，然后用0.9％NaCl平衡，直到洗脫液pH不再變化為止。