[發(fā)明專利]一種分離原代成人肝細(xì)胞的方法及其專用無菌器械盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110110477.1
• 申請日: 2011-04-29
• 公開（公告）號: CN102220278A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉思德;李愛民;林建華;趙芯梅;王亞東;匡雷
• 申請（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12M1/00
• 代理公司: 廣州知友專利商標(biāo)代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種分離原代細(xì)胞的方法，尤其是涉及一種分離原代成人肝細(xì)胞的方法，本發(fā)明還涉及用于分離原代成人肝細(xì)胞的專用無菌器械盒。

背景技術(shù)

肝細(xì)胞分離方法有多種，如機(jī)械分離法、鰲合法和酶消化法等。1956年Sorrentino第一次用機(jī)械的方法分離新鮮肝組織，但機(jī)械分離法獲得的肝細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量少、活性差，逐漸被棄用。1967年Howard創(chuàng)建了膠原酶灌流法(Howard?RB，Pesch?LA.Preparation?and?partial?characterization?of?intact?isolated?parenchymal?cells?from?rat?liver.Biol?Chem，1968，243：3105-3114)，1972年Seglen進(jìn)一步將這種方法發(fā)展為兩步灌流法(Seglen?PO.Preparation?of?isolated?rat?liver?cells.Method?Cell?Biol，1976，13：29-83)，使獲得的肝細(xì)胞數(shù)量和活性都得到了顯著提高，而且減少了肝細(xì)胞懸液中的雜質(zhì)。該方法要求從門靜脈置管，經(jīng)肝臟血管進(jìn)行灌流，目前已廣泛應(yīng)用于小鼠、大鼠、豬和犬等動物肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)。對于成人原代肝細(xì)胞的分離，利用肝移植手術(shù)配型不合而丟棄供肝進(jìn)行肝細(xì)胞分離仍然可以應(yīng)用該方法，利用手術(shù)切除的大塊肝臟組織進(jìn)行細(xì)胞分離也可以通過殘存的肝臟小血管置管進(jìn)行肝臟灌流(Lecluyse?EL，Alexandre?E.Isolation?and?culture?of?primary?hepatocytes?from?resected?human?liver?tissue.Methods?Mol?Biol，2010，640：57-82)。但是，目前肝移植的供肝極為緊張，而因配型不合丟棄的供肝更是稀缺，完全無法滿足基礎(chǔ)研究中對人肝細(xì)胞的巨大需求。隨著外科手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，伴隨病變切除的正常肝組織也逐漸變小，獲得的正常肝組織塊大多極不規(guī)則，很難找到合適的灌流血管，無法實施肝臟灌流，也就無法通過Seglen兩步法進(jìn)行細(xì)胞分離。因此，迫切需要一種簡便、容易的獲取成人肝細(xì)胞的方法，從而為應(yīng)用成人肝細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選、細(xì)胞移植等研究提供技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種簡單、經(jīng)濟(jì)的針對小塊離體不規(guī)則成人肝組織的分離原代成人肝細(xì)胞的方法。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種上述分離原代成人肝細(xì)胞的方法專用的一次性無菌器械盒，該器械盒可以即拆即用。

本發(fā)明的第一個目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種分離原代成人肝細(xì)胞的方法，其包括以下步驟：

(1)對已去除結(jié)締組織的離體成人肝組織用針頭注射器在組織表面進(jìn)行多點穿刺，注射前灌流液，直至整塊肝組織由暗紅色變?yōu)榛野咨伊鞒龅那肮嗔饕鹤兦辶粒?/p>

(2)另取針頭注射器在肝組織表面再次進(jìn)行多點穿刺，注射IV型膠原酶溶液，直至整塊肝組織塊變疏松、失去彈性，表面呈龜背狀裂隙；

(3)分離肝組織，去除殘存的包膜和纖維結(jié)締組織，放入無菌瓶中，加入IV型膠原酶溶液在37℃溫度下震蕩消化得到消化物；

(4)將消化物吹打成為細(xì)胞懸液，在冰浴條件下過濾，收集過濾后的肝細(xì)胞懸液，移至離心管中，離心處理后去上清液，底層沉淀加入紅細(xì)胞裂解液，室溫靜置2～3分鐘后，再進(jìn)行離心，收集底層沉淀，用肝細(xì)胞洗滌緩沖液重懸肝細(xì)胞，再次過濾、離心處理后棄上清液，收集底層沉淀物；

(5)對步驟(4)中得到的底層沉淀物用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌后得到原代成人肝細(xì)胞。

本發(fā)明所述步驟(1)中所述的多點穿刺注射為用帶針頭的注射器在成人肝組織表面選取多個穿刺點，依次穿刺注射前灌注液，穿刺注射總時間控制在10～15分鐘的范圍內(nèi)，在實際操作中，注射前灌注液時所選取的穿刺點的個數(shù)應(yīng)根據(jù)具體肝組織的大小來決定，并以使整塊肝組織全部由暗紅色變?yōu)榛野咨伊鞒龅那肮嗔饕鹤兦辶翞榕袛鄻?biāo)準(zhǔn)，一般來說，至少需要取20個穿刺點。整個穿刺灌注過程中成人肝組織均在放置于冰袋之上的培養(yǎng)皿中進(jìn)行。

本發(fā)明所述步驟(1)中所述的前灌流液主要成分為NaCl?8g/L、KCl?0.4g/L、Na₂HPO₄·12H₂O?0.12g/L、KH₂PO₄?0.06g/L、NaHCO₃?0.35g/L、葡萄糖1.0g/L、HEPES2.38g/L、EDTA?0.74g/L。