[發(fā)明專利]一種分離原代成人肝細(xì)胞的方法及其專用無(wú)菌器械盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110110477.1
• 申請(qǐng)日: 2011-04-29
• 公開（公告）號(hào): CN102220278A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉思德;李愛民;林建華;趙芯梅;王亞?wèn)|;匡雷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12M1/00
• 代理公司: 廣州知友專利商標(biāo)代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國(guó)華

1.一種分離原代成人肝細(xì)胞的方法，其特征在于，其包括以下步驟：

(1)對(duì)已去除結(jié)締組織的離體成人肝組織用針頭注射器在組織表面進(jìn)行多點(diǎn)穿刺，注射前灌流液，直至整塊肝組織由暗紅色變?yōu)榛野咨伊鞒龅那肮嗔饕鹤兦辶粒?/p>

(2)另取針頭注射器在肝組織表面再次進(jìn)行多點(diǎn)穿刺注射IV型膠原酶溶液，直至整塊肝組織塊變疏松、失去彈性，表面呈龜背狀裂隙；

(3)分離肝組織，去除殘存的包膜和纖維結(jié)締組織，放入無(wú)菌瓶中，加入IV型膠原酶溶液在37℃溫度下震蕩消化得到消化物；

(4)將消化物吹打成為細(xì)胞懸液，在冰浴條件下過(guò)濾，收集過(guò)濾后的肝細(xì)胞懸液，移至離心管中，離心處理后去上清液，底層沉淀加入紅細(xì)胞裂解液，室溫靜置2～3分鐘后，再進(jìn)行離心，收集底層沉淀，用肝細(xì)胞洗滌緩沖液重懸肝細(xì)胞，再次過(guò)濾、離心處理后棄上清液，收集底層沉淀物；

(5)對(duì)步驟(4)中得到的底層沉淀物用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基洗滌后得到原代人肝細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原代成人肝細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的步驟(1)所述的離體成人肝組織在體外熱缺血時(shí)間控制在20分鐘以內(nèi)；而所述的離體人肝組織冷缺血時(shí)間控制在30～60分鐘內(nèi)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原代成人肝細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟(1)中多點(diǎn)穿刺注射為用帶針頭的注射器在肝組織表面選取多個(gè)穿刺點(diǎn)，依次穿刺注射前灌注液，穿刺灌注總時(shí)間控制在10～15分鐘的范圍內(nèi)；所述步驟(2)中的前灌流液成分包含NaCl?8g/L、KCl?0.4g/L、Na₂HPO₄·12H₂O?0.12g/L、KH₂PO₄0.06g/L、NaHCO₃?0.35g/L、葡萄糖1.0g/L、HEPES?2.38g/L、EDTA?0.74g/L；所述步驟(2)中的前灌注液的溫度為4℃，且前灌注液只一次性使用。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原代成人肝細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的多點(diǎn)穿刺注射為用帶針頭的注射器在肝組織表面選取多個(gè)穿刺點(diǎn)，依次穿刺注射IV型膠原酶溶液，穿刺注射總時(shí)間控制在10～15分鐘的范圍內(nèi)；所述的IV型膠原酶溶液的溫度為38℃，且IV型膠原酶溶液循環(huán)使用；所述步驟(2)的操作全過(guò)程在放置于38℃熱水袋之上的培養(yǎng)皿中進(jìn)行。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原代成人肝細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟(2)和步驟(3)中所述IV型膠原酶溶液是由IV型膠原酶溶于DMEM培養(yǎng)基配制而成，IV型膠原酶的重量百分比濃度為0.05％-0.1％；所述步驟(3)中所述的震蕩消化條件為：在恒溫?fù)u床中在37℃下以120～150轉(zhuǎn)/分鐘的速度消化15～20分鐘；所述步驟(3)中IV型膠原酶溶液的用量根據(jù)肝組織大小重量來(lái)確定。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原代成人肝細(xì)胞的方法，其特征在于，；所述步驟(4)中所述的紅細(xì)胞裂解液的采用濃度為0.15M的氯化銨溶液，所述的紅細(xì)胞裂解液的用量與肝細(xì)胞懸液的體積比為1∶3～1∶4；所述的消化物吹打成為的細(xì)胞懸液后采用100目濾網(wǎng)過(guò)濾，而肝細(xì)胞洗滌緩沖液重懸肝細(xì)胞后用200目濾網(wǎng)過(guò)濾。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原代成人肝細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟(4)中所述的肝細(xì)胞洗滌緩沖液采用含DNase?I的肝細(xì)胞洗滌緩沖液，所述含DNaseI的肝細(xì)胞洗滌緩沖液的成分包含DNase?I?0.15g/L、CaCl₂?0.12g/L、MgSO₄·7H₂O0.15g/L；所述的含DNase?I的肝細(xì)胞洗滌緩沖液的用量是為所述步驟(3)中IV型膠原酶溶液用量的2倍。

8.一種權(quán)利要求1～2任一權(quán)利要求所述的分離原代成人肝細(xì)胞的方法專用的一次性無(wú)菌器械盒，其特征在于，其包括盒體和操作器械，所述的操作器械包括培養(yǎng)皿、燒杯、血清瓶、三角燒杯、兩個(gè)濾網(wǎng)、注射器、15ml離心管、鑷子和剪刀；所述盒體內(nèi)設(shè)置多個(gè)與所述各個(gè)操作器械的形狀、體積吻合的凹槽，所述的各個(gè)操作器械對(duì)應(yīng)嵌裝在相應(yīng)盒體內(nèi)的凹槽中。