[發明專利]一種石斑魚虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法

有效

• 申請號: 201110110422.0
• 申請日: 2011-04-29
• 公開（公告）號: CN102242173A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 秦啟偉;歐陽征亮;公杰;黃曉紅;黃友華
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/01;C07K1/14;C12R1/93
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明涉及病毒囊膜蛋白的提取方法，具體地講涉及一種石斑魚虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法。

背景技術

病毒結構蛋白是病毒形態發生所必需的蛋白質，也是構成具有侵染力的成熟病毒顆粒所必需的成分。在有囊膜病毒中，病毒的結構蛋白主要有衣殼蛋白（capsid?protein）、囊膜蛋白（envelope?protein）以及基質蛋白（matrix?protein）。在這些蛋白中，囊膜蛋白由于位于病毒粒子的最外側，并且被認為是病毒入侵吸附識別時的配體分子，因此受到廣泛的關注。囊膜是包被著病毒衣殼的一層膜，病毒囊膜的成分主要來自宿主細胞，由蛋白質、脂質及多糖等組成。病毒完成裝配，從宿主細胞中釋放出來，細胞膜雙層磷脂中原有的細胞源性蛋白被病毒蛋白完全或部分取代，成為病毒的囊膜蛋白。囊膜在病毒感染、復制及致病過程中起重要作用。囊膜蛋白的主要功能有：（1）是病毒的主要表面抗原，可以誘導機體產生保護性的中和抗體。（2）具有凝集脊椎動物紅血球細胞、細胞融合以及酶等活性。（3）與靶細胞結合。對病毒囊膜蛋白的研究將有利于發現與闡明病毒感染、復制及裝配的機理，為研究病毒宿主相互作用機制和病毒防治提供依據。

對于病毒囊膜蛋白的研究，病毒囊膜的分離純化是研究的基礎和起點。大多數囊膜蛋白是和膜及病毒衣殼整合在一起的，所以分離提純比較困難。用表面活性劑溶解囊膜是純化囊膜蛋白的常用策略，囊膜在表面活性劑的作用下可變成蛋白質-脂肪-表面活性劑的復合物而被溶解。囊膜被溶解后，可以采用電泳技術分離純化囊膜蛋白進而進行質譜鑒定。?

表面活性劑是分離提純囊膜蛋白的關鍵性試劑，用合適的表面活性劑溶解囊膜是純化囊膜蛋白的第一步。表面活性劑可以分為幾大類，主要有（1）離子型表面活性劑，如十二烷基磺酸鈉（SDS）、脫氧膽酸鈉（DOC）；（2）溫和非離子型表面活性劑，如曲拉通X-100（Triton?X-100）、乙基苯基聚乙二醇（NP-40）；(3)溫和型兩性表面活性劑，如DDMAU、DDMAB。在囊膜的提取中，表面活性劑的選擇很關鍵，臨界微團濃度、親水-親脂物平衡值、電荷及紫外穿透性等是選擇表面活性劑的主要考慮因素。1%?Triton-X?100是分離病毒囊膜比較常用的方法，常用于如牛流行熱病毒（bovine?ephemeral?fever?virus,?BEFV）和對蝦白斑綜合癥病毒（white?spot?syndrome?virus,?WSSV）等病毒的囊膜的分離。此外，痘苗病毒(vaccinia?virus,?VV)?的囊膜用1%?NP-40溶液（1%?NP-40、50?mM?Tris?(pH?7.4)?、150?mM?NaCl和50?mM?DTT）能得到了很好的分離。

迄今為止，僅有少數的幾篇關于虹彩病毒囊膜蛋白的報道。而對于有囊膜虹彩病毒的囊膜提取方法，缺乏全面的比較和研究。本發明在比較了幾種不同的表面活性劑分離石斑魚虹彩病毒囊膜蛋白的效果后，建立了一種分離虹彩病毒囊膜蛋白的合適方法。

發明內容

針對現有技術的缺乏和不足之處，本發明提供一種虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法。

本發明通過以下方案實現：

一種石斑魚虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法，其特征在于包括以下步驟：①石斑魚胚胎細胞接種石斑魚虹彩病毒，待細胞出現完全病變效應時，收集病毒懸液；②收集的病毒懸液凍融2-3次，去除細胞碎片，取上清液進行超速離心，收集病毒粒子，用蔗糖密度梯度離心得到純化的病毒粒子；③將純化的病毒粒子用0.1%?SDS室溫處理30分鐘。??

步驟②所述超速離心為28000rpm離心90分鐘。

步驟②凍融是指將病毒懸液放入低溫冰箱或液氮中凍存后取出室溫溶解。

步驟①是將接種病毒的石斑魚胚胎細胞經過磷酸緩沖鹽溶液漂洗后加入質量分數0.25%的胰蛋白酶消化1-2分鐘，加入新配置的pH?7.4～7.6的含8-10%胎牛血清的MEM培養液，25-28℃進行培養擴增；待細胞生長至對數期時接種0.01-0.1?MOI的病毒，于25-28℃培養3-4天后，收集病毒懸液。

步驟②去除細胞碎片的方法為12,000g離心30分鐘，取出上清液，其沉淀用磷酸緩沖鹽溶液重懸并反復凍融3次后再超聲波破碎，4,000g離心20分鐘。

步驟②所述蔗糖密度梯度離心為將病毒懸浮液加于30%-60%蔗糖密度梯度上，150,000?g?4℃離心1小時，收集密度梯度40%-50%之間的條帶，溶于TN?buffer中；100,000?g?4℃離心1小時得到純化的病毒粒子。