[發明專利]一種石斑魚虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法

有效

• 申請號: 201110110422.0
• 申請日: 2011-04-29
• 公開（公告）號: CN102242173A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 秦啟偉;歐陽征亮;公杰;黃曉紅;黃友華
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/01;C07K1/14;C12R1/93
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

1.一種石斑魚虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法，其特征在于包括以下步驟：①石斑魚胚胎細胞接種石斑魚虹彩病毒，待細胞出現完全病變效應時，收集病毒懸液；②收集的病毒懸液凍融2-3次，去除細胞碎片，取上清液進行超速離心，收集病毒粒子，用蔗糖密度梯度離心得到純化的病毒粒子；③將純化的病毒粒子用質量分數0.1%?SDS室溫處理30分鐘。

2.如權利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟②所述超速離心為28000rpm離心90分鐘。

3.?如權利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟②凍融是指將病毒懸液放入低溫冰箱或液氮中凍存后室溫溶解。

4.如權利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟①是將接種病毒的石斑魚胚胎細胞經過磷酸緩沖鹽溶液漂洗后加入質量分數0.25%的胰蛋白酶消化1-2分鐘，加入新配置的pH?7.4～7.6的含8-10%胎牛血清的MEM培養液，25-28℃進行培養擴增；待細胞生長至對數期時接種0.01-0.1?MOI的病毒，于25-28℃培養3-4天后，收集病毒懸液。

5.如權利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟②去除細胞碎片的方法為12,000g離心30分鐘，取出上清液，其沉淀用磷酸緩沖鹽溶液重懸并反復凍融3次后再超聲波破碎，4,000g離心20分鐘。

6.如權利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟②所述蔗糖密度梯度離心為將病毒懸浮液加于30%-60%蔗糖密度梯度上，150,000?g?4℃離心1小時，收集密度梯度40%-50%之間的條帶，溶于TN?buffer中；100,000?g?4℃離心1小時得到純化的病毒粒子。

7.如權利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟①收集的病毒懸液于-20～-80℃凍存保存。

8.如權利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟②收集的病毒粒子用磷酸緩沖鹽溶液重懸溶解后再進行蔗糖密度梯度離心。

9.如權利要求6所述的提取方法，其特征在于所述TN?buffer為50?mM?Tris?/HCl與150?mM?NaCl的混合物，其pH?為7.5。