[發(fā)明專利]一種石斑魚虹彩病毒保護性抗原的篩選方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110110400.4
• 申請日: 2011-04-29
• 公開（公告）號: CN102277361A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 歐陽征亮;秦啟偉;汪沛然;黃曉紅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12N15/34
• 分類號: C12N15/34;C12N15/10;A61K48/00;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于疫苗生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地講涉及一種石斑魚虹彩病毒保護性抗原的篩選方法。

背景技術(shù)

石斑魚肉質(zhì)鮮美蛋白含量高，是一種經(jīng)濟價值很高的食用魚類，也是我國創(chuàng)匯的優(yōu)良魚類品種。但近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖環(huán)境的日益惡化，各種病害特別是病毒性疾病頻繁爆發(fā)，造成了重大的經(jīng)濟損失。虹彩病毒是石斑魚的重要致病病原。它可以造成魚類的死亡率從30%(成魚中)到100%(幼苗階段)。這種病毒在亞洲，特別是在22℃以上的高水溫時，極易感染中國、日本和東南亞等國養(yǎng)殖的海水名貴魚類，如石斑魚、尖吻鱸、真鯛、牙鲆和大黃魚等，致使魚類大面積的死亡，造成嚴重的經(jīng)濟損失，因而被稱之為“海洋口蹄疫”。石斑魚虹彩病毒(Singapore?grouper?iridovirus,?SGIV)是從養(yǎng)殖的石斑魚中分離到的一株新的虹彩病毒，可導致石斑魚死亡率達90%以上，給石斑魚的養(yǎng)殖帶來巨大的經(jīng)濟損失。因此，如何預(yù)防和治療虹彩病毒病已成為當今世界上石斑魚養(yǎng)殖業(yè)急需解決的重要問題。

目前，針對各種魚類病毒性疾病，大都沒有可根治的特效藥物，只能通過提高魚類機體自身免疫能力，及時發(fā)現(xiàn)病害并采取相應(yīng)措施防止擴散等防治辦法來降低病毒感染魚體的機會。同時傳統(tǒng)抗生素和化學合成藥物的濫用，帶來了藥物殘留、誘變產(chǎn)生抗藥菌株及導致水體污染等嚴重問題。而疫苗作為控制病原最有力的手段，是治療疾病、特別是病毒病的最好選擇。水產(chǎn)病害疫苗研究在最近幾十年來得到了長足的發(fā)展。然而有關(guān)虹彩病毒的疫苗，特別是基因工程疫苗的研制報道很少。Caipang等構(gòu)建了真鯛虹彩病毒的2個抗原性基因的DNA疫苗，并用它們對真鯛幼魚進行免疫實驗，結(jié)果顯示該疫苗誘導了機體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生了較好的保護效果。Tamaru等利用釀酒酵母成功表達了真鯛虹彩病毒的主要衣殼蛋白，非常適合用于制備口服疫苗。Kim等構(gòu)建了條石鯛虹彩病毒主要衣殼蛋白的重組蛋白疫苗，免疫條石鯛，對照組死亡率90%，而免疫組僅為5-15%。國內(nèi)的研究者何建國等構(gòu)建了ISKNV的2個基因工程疫苗，中試試驗表明這2個基因工程疫苗聯(lián)合免疫鱖魚，在對照組死亡率100%的情況下，免疫組鱖魚成活率達到70%，說明基因工程疫苗用于免疫保護鱖魚的可行性較高。另外孫修勤等用不同的物質(zhì)包裹牙鲆淋巴囊腫病毒的DNA疫苗，在口服DNA疫苗方面做出了很好的嘗試。然而，到目前為止，還沒有見到石斑魚虹彩病毒基因工程疫苗的報道。而且針對虹彩病毒疫苗的研究，多數(shù)研究者僅局限于少數(shù)幾個保護性抗原，對虹彩病毒的保護性抗原缺乏一個比較全面的了解。隨著基因工程疫苗的研制在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到了越來越多的重視，靶抗原的鑒定顯得越發(fā)重要。為此，采用反向疫苗學的分析方法結(jié)合DNA疫苗技術(shù)，篩選出能提供保護作用的病毒編碼基因，為研制新型的石斑魚虹彩病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種石斑魚虹彩病毒保護性抗原基因。

本發(fā)明的另一目的是提出一種石斑魚虹彩病毒保護性抗原的篩選方法，具體為來自石斑魚虹彩病毒的具有疫苗開發(fā)前景的保護性抗原基因的鑒定。

本發(fā)明同時提供了一種石斑魚虹彩病毒保護性DNA疫苗。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實施：

一種石斑魚虹彩病毒保護性抗原基因，其特征在于基因的核苷酸序列如SEQ?ID：No1或2或3所示。

一種如權(quán)利要求1所述抗原基因的篩選方法，其特征在于包括以下步驟：①在石斑魚虹彩病毒編碼基因中排除假的開放閱讀框及定位于胞質(zhì)和胞核中的蛋白和小于140個氨基酸的蛋白后，通過同源性分析、蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析及信號肽與跨膜區(qū)分析，篩選跨膜蛋白和分泌蛋白，得到疫苗候選基因；②篩選出的疫苗候選基因PCR擴增全長，構(gòu)建各個基因的DNA疫苗；③使用DNA疫苗免疫石斑魚幼魚，篩選出能產(chǎn)生明顯免疫保護作用的抗原。

石斑魚虹彩病毒保護性DNA疫苗，由以下方法獲得：以SEQ?ID：No1或2或3為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物連接到pcDNA?3.1載體獲得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5α后，培養(yǎng)12~16小時，提取質(zhì)粒DNA獲得所述的DNA疫苗。

石斑魚虹彩病毒保護性DNA疫苗的應(yīng)用方法，將DNA疫苗進行肌肉注射注入石斑魚體內(nèi)。

石斑魚虹彩病毒保護性DNA疫苗的應(yīng)用方法，每次注射DNA疫苗50-100μL，所含質(zhì)粒DNA為30-50μg。