[發明專利]檢測重度抑郁關聯基因的試劑盒及其制備方法

無效

• 申請號: 201110109934.5
• 申請日: 2011-04-29
• 公開（公告）號: CN102191329A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發明（設計）人: 師詠勇;王倜;賀林;陳培華
• 申請（專利權）人: 上海交通大學;上海佰真生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及的是一種分子生物技術領域的試劑盒及其制備方法，具體地說是一種檢測重度抑郁關聯基因的試劑盒及其制備方法。

背景技術

連接酶可以對與目標序列完全互補的兩條寡核苷酸片段進行連接，進而形成一條較長的寡核苷酸探針，如果兩條寡核苷酸探針連接處的堿基與目標序列不完全互補，那么連接反應就不會發生，也就不會產生較長的寡核苷酸探針。根據這一原理，根據SNP位點的基因型設計不同長度的寡核苷酸探針，可以對SNP位點的基因型進行檢測。根據最終產物的長度分類，可以確定SNP位點的基因型，這就是連接酶檢測反應(Ligase?Detection?Reaction)。

人類基因組是遺傳信息的最終載體，人類個體之間的差異根本原因也在于基因組序列的差異。單核苷酸多態性(SNP)正是表征這種差異的常用的遺傳標記，在人類基因組上大概每一千個堿基對，就包含有一個SNP。雙生子實驗等證明，重度抑郁是一種復雜的遺傳疾病，遺傳度高達60％左右。現代遺傳學研究表明，各種遺傳疾病都會被某些SNP位點所表征，也就是說，某些SNP位點與遺傳疾病呈現出關聯性。全基因組關聯研究的出現，更為尋找關聯位點提供了有力的技術支持。這些強關聯SNP位點可以作為一種患病風險的表征。

現在對SNP位點的分型，常用的方法有AB公司的TaqMan探針技術，測序技術等。TaqMan探針要從AB公司定制，周期較長而且價格較為昂貴。測序技術雖然結果較為可靠，但是對特定位點的SNP分型，該方法相對成本較高，花費時間也比較長。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種檢測重度抑郁關聯基因的試劑盒及其制備方法，本發明操作簡便，成本低廉，針對重度抑郁而開發。結果可靠，穩定性好，靈敏度高。

本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明涉及檢測重度抑郁關聯基因的試劑盒，包括：PCR試劑組和LDR(連接酶檢測反應)試劑組，兩個試劑組包裝在同一個盒子中，PCR試劑組，包括：緩沖液、dNTP混合液、Taq?DNA聚合酶、純水和四對PCR專用擴增引物；LDR試劑組，包括：緩沖液、dNTP混合液、Taq?DNA連接酶、純水和四組LDR專用探針。

所述的PCR試劑組，dNTP混合液的濃度為10mM，Taq?DNA聚合酶的濃度為2unit/ul，四對PCR擴增引物為2OD的干粉，使用時，先8000rpm離心十分鐘，然后加入純水溶解，震蕩均勻后可以使用。

所述的LDR試劑組，Taq?DNA聚合酶的濃度為40unit/ul，四對PCR擴增引物為2OD的干粉，使用時，先8000rpm離心十分鐘，然后加入純水溶解，混合均勻后可以使用。

本發明還涉及如上述的檢測重度抑郁關聯基因的試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

①PCR引物的設計及合成：PCR引物采用引物設計軟件PRIMER3進行引物設計，TM值選擇60度左右；

②LDR探針的設計及合成：LDR探針每個位點包括三條，兩條5’端探針和一條3’端探針；

③Taq?DNA聚合酶和Taq?DNA連接酶采用TAKARA的產品或New?England?Biolabs的產品。

所選用市售TAKARA的產品或New?England?Biolabs的產品(配套試劑，包括緩沖液，dNTP等均選用市售常用試劑之)。

所述的LDR探針：兩條5’端探針長度相差2個堿基，反映在該探針的5’端。

所述的LDR探針：兩條5’端探針的3’端的最后一個堿基根據SNP位點的基因型確定。

所述的LDR探針：兩條5’端探針在距5’端6個堿基的位置認為引入與目標序列不互補的一個堿基，目的是增大檢測的準確度。

所述的LDR探針：5’端探針的5’末端及3’端探針的3’末端均采用polyT的序列，目的是使產物達到利于檢測的長度。

所述的LDR探針：除上述三點描述外，5’端探針的其他位置與目標序列完全互補。

所述的LDR探針：3’端探針與目標序列完全互補，且在其5’端加磷酸修飾，其3’端加FAM熒光修飾。

所述的PCR引物的設計及合成中每個位點對應的引物的序列如下：