[發明專利]一種糙皮側耳EST-SSR分子標記特異引物體系及其應用

無效

• 申請號: 201110108721.0
• 申請日: 2011-04-28
• 公開（公告）號: CN102181559A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 姚強;宮志遠;高興喜;張雪梅;韓建東;任鵬飛;萬魯長;任海霞;趙軍勝;李瑾;曲玲
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院農業資源與環境研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 許德山

技術領域

本發明涉及糙皮側耳EST-SSR分子標記特異引物體系及其應用，屬于分子生物學技術領域。

技術背景

糙皮側耳是我國第一大食用菌栽培菌種。在人們長期的生產實踐中，積累了豐富而珍貴的糙皮側耳種質資源，特別是近年來，隨著糙皮側耳栽培產業的迅速發展，糙皮側耳的種質資源也在不斷擴大。據不完全統計，目前我國糙皮側耳栽培品種(包括國外引進菌種)已達300多個。豐富的種質資源為糙皮側耳品種改良、新品種選育以及遺傳工程奠定了基礎。然而，糙皮側耳種質資源庫不斷擴大，對育種工作者來說，要想知道這些育種材料的詳細信息，并進行深入細致的評價鑒定，變得越來越困難。特別是由于我國食藥用菌品種登記制度尚未完善，糙皮側耳的生產用菌種比較混亂，同種異名和同名異種現象在栽培生產上非常普遍，這就給育種工作者正確評價和鑒定這些種質資源帶來很大的不便。因此，如何更有效地保存和開發利用現有糙皮側耳種質資源，特別是對特異種質材料進行有效地篩選和挖掘，是當前迫切需要解決的問題。

目前，用于作物種質資源鑒定的分子標記主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，但對于核心種質構建、基因性狀鑒定、品種指紋圖譜建庫等研究，SSR分子標記是公認的最佳方法。

開發SSR標記主要有構建與篩選基因組文庫法、微衛星富集法、省略篩庫法和數據庫搜索法等。其中數據庫搜索法，尤其是從表達序列標簽(EST)數據庫中搜索，開發EST-SSR標記，已經成為一種廣為采用的方法。EST-SSR標記相對于基因組SSR標記而言，由于其來自于轉錄譜，能夠反映出轉錄區的差異，使EST-SSR標記可以直接與目標性狀(如高產或多抗)相聯系，在分子標記輔助選擇上具有更高的應用價值。

然而，由于食藥用真菌基因組學研究的相對滯后，EST-SSR標記技術在食藥用真菌中的研究很少，僅見在香菇和真姬菇中有研究報道，而在糙皮側耳中尚未開展該方面的研究。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種糙皮側耳EST-SSR分子標記特異引物體系及其應用。

一種糙皮側耳EST-SSR分子標記特異引物體系，它包括4對核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子標記特異引物：

GL1F：ctgctcgttgtacacgcttc(SEQ?ID?NO.1)，GL1R：gaaagacagacgcgggatta；(SEQ?ID?NO.2)；

GL2F：ggtaatctcggcttcacgat(SEQ?ID?NO.3)，GL2R：ttgagaatcttcggcacctc(SEQ?ID?NO.4)；

GL4F：gagcaggcgatctctttcaa(SEQ?ID?NO.5)，GL4R：gcgaagggagtggtacacat(SEQ?ID?NO.6)；

GL19F：agtacgtagctgccgtccag(SEQ?ID?NO.7)，GL19R：cctgatacgtcccgtaacca(SEQ?ID?NO.8)。

上述體系，還包括核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子標記特異引物：

GL26F：tatgggcatgatgaagaacg(SEQ?ID?NO.9)，GL26R：cgacgacgacgactatgaga(SEQ?ID?NO.10)。

上述體系，還包括核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子標記特異引物：

GL38F：tctttacatccacgccatga(SEQ?ID?NO.11)，GL38R：caaagtgaaggtgagcgaca(SEQ?ID?NO.12)。

上述EST-SSR分子標記特異引物體系在糙皮側耳遺傳多樣性分析和種質資源鑒定方面的應用。

上述應用，步驟如下：

(1)提取樣品DNA；

(2)以步驟(1)提取的DNA為模板，利用EST-SSR分子標記特異引物體系中的成對引物分別PCR擴增EST-SSR分子標記，得PCR產物；

(3)將步驟(2)制得的得PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對結果進行遺傳多樣性分析和多態性統計分析。

所述步驟(1)提取樣品DNA，步驟如下：

(i)刮取菌絲用液氮研磨，加入CTAB及RNA酶于60-65℃水浴1-2h；

(ii)4℃?12000rpm離心10min，取上清加入等體積的氯仿異戊醇混合液(氯仿與異戊醇體積比24∶1)，混勻后，4℃?12000rpm離心10min；

(iii)重復步驟(ii)；