[發(fā)明專利]一種糙皮側(cè)耳EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110108721.0
• 申請(qǐng)日: 2011-04-28
• 公開（公告）號(hào): CN102181559A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚強(qiáng);宮志遠(yuǎn);高興喜;張雪梅;韓建東;任鵬飛;萬魯長(zhǎng);任海霞;趙軍勝;李瑾;曲玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 許德山

1.一種糙皮側(cè)耳EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系，它包括4對(duì)核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子標(biāo)記特異引物：

GL1F：ctgctcgttgtacacgcttc，GL1R：gaaagacagacgcgggatta；

GL2F：ggtaatctcggcttcacgat，GL2R：ttgagaatcttcggcacctc；

GL4F：gagcaggcgatctctttcaa，GL4R：gcgaagggagtggtacacat；

GL19F：agtacgtagctgccgtccag，GL19R：cctgatacgtcccgtaacca。

2.如權(quán)利要求1所述的特異引物體系，其特征在于，還包括核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子標(biāo)記特異引物：

GL26F：tatgggcatgatgaagaacg，GL26R：cgacgacgacgactatgaga。

3.如權(quán)利要求1所述的特異引物體系，其特征在于，還包括核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子標(biāo)記特異引物：

GL38F：tctttacatccacgccatga，GL38R：caaagtgaaggtgagcgaca。

4.權(quán)利要求1所述EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系在糙皮側(cè)耳遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒定方面的應(yīng)用。

5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下：

(1)提取樣品DNA；

(2)以步驟(1)提取的DNA為模板，利用EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系中的成對(duì)引物分別PCR擴(kuò)增EST-SSR分子標(biāo)記，得PCR產(chǎn)物；

(3)將步驟(2)制得的得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行遺傳多樣性分析和多態(tài)性統(tǒng)計(jì)分析。

6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(1)提取樣品DNA，步驟如下：

(i)刮取菌絲用液氮研磨，加入CTAB及RNA酶于60-65℃水浴1-2h；

(ii)4℃12000rpm離心10min，取上清加入等體積的氯仿異戊醇混合液，混勻后，4℃12000rpm離心10min；

(iii)重復(fù)步驟(ii)；

(iv)取上清加入2倍體積的無水乙醇于-20℃靜置2h；

(v)4℃8000rpm離心10min，棄上清，用70％乙醇洗2-3次，倒置晾干，加入適量TE溶解，即得樣品DNA。

7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(2)的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：

糙皮側(cè)耳基因組DNA?50-100ng，10×緩沖液2.5μL，2.5mmol的dNTPs?2μL，2.5U·μL^-1Taq酶0.25μL，濃度為10μM·L^-1的正向引物溶液1μL，濃度為10μM·L^-1的反向引物溶液1μL，添加ddH₂O至體系體積為25μL；

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min后進(jìn)入循環(huán)；94℃變性30s；53～56℃復(fù)性45s；72℃延伸1min，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

8.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(3)的瓊脂糖凝膠電泳為2％的瓊脂糖凝膠電泳。

9.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(3)的遺傳多樣性分析是根據(jù)EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系中的特異引物在糙皮側(cè)耳樣品DNA的擴(kuò)增結(jié)果，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)清晰穩(wěn)定的條帶后，應(yīng)用非加權(quán)類平均聚類方法對(duì)糙皮側(cè)耳樣品進(jìn)行聚類分析。

10.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(3)的多態(tài)性統(tǒng)計(jì)分析是根據(jù)統(tǒng)計(jì)在同一電泳遷移位置擴(kuò)增條帶的有無，有擴(kuò)增條帶的記為1，沒有擴(kuò)增條帶的記為0，生成分子數(shù)據(jù)矩陣；然后，利用NTSYS?2.1軟件的非加權(quán)平均數(shù)法進(jìn)行了聚類分析。